原子間力顕微鏡(AFM)剛性測定のための網膜微小血管内皮細胞(REC)培養物からの内皮下マトリックスの収集

まず、カルシウムマグネシウムを含むPBSでグルタルアルデヒド架橋ゼラチンコーティングされたカバースリップをオービタルシェーカーで約5回すすぎます。最初の3回のすすぎでは、滅菌ピンセットを使用してカバースリップを持ち上げ、グルタルアルデヒドを完全にすすぎます。.次に、マウスRECsの培養培地を、滅菌済みのろ過済みアスコルビン酸を添加した新しい培地に置き換えます。

15日間の治療後、カルシウムマグネシウムフリーPBSで細胞をすすぎます。細胞を250マイクロリットルの温かい脱細胞化緩衝液で2〜3分間インキュベートします。位相差顕微鏡で細胞の脱細胞化を確認します。

REC分泌内皮下マトリックスを乱さずに、バッファーを静かにピペットで取り出します。次に、各ウェルに0.5ミリリットルのPBSを追加します。PBSを取り外した後、200マイクロリットルのRNaseフリーDNaseを追加します。

混合物を摂氏37度で30分間インキュベートし、すべての細胞の破片を取り除きます。次に、Macroscaleの線維性内皮下マトリックスを位相コントラスト顕微鏡で観察します。次に、共焦点顕微鏡を使用して、より細かいナノスケールのマトリックスファイバーを100倍の倍率で観察します。

ヒトまたはマウスRECsの10日または15日の培養の脱細胞化後のガラスカバースリップ上に内皮下マトリックス凝集体が観察されました。脱細胞化マトリックスの共焦点顕微鏡法では、高密度のナノ繊維状コラーゲン-IVおよびフィブロネクチンマトリックスが示されました。