角膜内皮細胞層への色素のバイオアベイラビリティを評価するためのHoechstの皮内注射

まず、5マイクロリットルのヘキスト溶液を滅菌済みの10マイクロリットルのガラス製ハミルトンシリンジにロードし、34ゲージの鈍い針に取り付けます。このシリンジ針をセルフシール角膜トンネルを介して前房に挿入し、溶液を注入します。すべての液体がなくなるまで、針を2〜3秒間所定の位置に保持します。

針をゆっくりと引き出して取り外し、漏れを防ぎます。次に、両目を摘出します。角膜を分離するには、視神経の周りの強膜を切断し、視神経から角膜に向かってさらに4つの切断を行います。

Whatman濾紙で余分な液体を排出します。切り傷した強膜を広げ、網膜を強膜から分離します。レンズと網膜を引き出して廃棄します。

次に、虹彩を外します。角膜の周りの強膜を切って捨てます。そして角膜を慎重に持ち上げます。

角膜をスライドガラスの上に置き、0.5%アリザリンレッドで染色して内皮細胞を特定します。余分な汚れを取り除いた後、角膜を3回洗い、その上にカバースリップを置きます。光学顕微鏡で角膜を検査し、内皮細胞のアリザリンレッド染色を画像化します。

また、蛍光顕微鏡で角膜を評価してヘキスト染色を観察し、コントロールとして注射していない角膜と比較します。DNA結合細胞透過性蛍光マーカーであるHoechst色素は、前房内注射による薬物のバイオアベイラビリティの評価に利用されました。hoechstの角膜内皮細胞の取り込みは、蛍光顕微鏡法により注射後15分で調べられました。

Alizarin Red染色は、内皮層の細胞間境界を強調しました。また、角膜内皮細胞核内での陽性のヘキスト染色により、この方法による色素の送達が成功したことが確認されました。