脳疾患に対する免疫応答を研究するためのマウス脳からの単一細胞懸濁液の調製

単離されたニューロン脳から単一細胞懸濁液を得るには、脳を、適切な量の氷冷ハンクス平衡塩溶液、またはHBSSバッファーを含む予冷された15ミリリットルガラス製Dounceホモジナイザーに入れます。ゆるいDounce乳棒を使用して、氷上で約100〜120回のストロークで脳組織を穏やかかつゆっくりと解離させます。得られた脳組織懸濁液を、50ミリリットルの遠心チューブ内の70ミクロンの細胞ストレーナーでろ過します。

Dounceチューブを5ミリリットルのHBSSですすぎ、細胞コレクションを最大化するためにろ過を進めます。ろ過した組織懸濁液を550gで摂氏4度で6分間遠心分離します。真空吸引器を使用して上清を除去し、細胞口蓋を1ミリリットルの30%等張密度勾配溶液に再懸濁します。

細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。適量の30%密度勾配溶液を加え、チューブを静かに反転させて完全に混合します。加速とブレーキをレベル3に設定し、摂氏4度で20分間、チューブを845gで直ちに遠心分離します。

完了したら、チューブを振らずに遠心分離機から静かに取り外し、真空に接続された1ミリリットルの先端を使用して上部ミエリン層を慎重に吸引します。次に、上清を吸引し、1〜2ミリリットルを残し、細胞口蓋を最低10ミリリットルの冷たいHBSSで再懸濁します。550 gで摂氏4度で6分間遠心分離します。

最低7ミリリットルの冷たいHBSSでもう一度洗浄し、再度遠心分離します。上清をできるだけ多く取り除いた後、フローサイトメトリー分析用の100〜200マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーに細胞を再懸濁します。