セレノプロテインOの分子間相互作用を明らかにするためのサーマルシフトアッセイ

まず、サーマルシフトアッセイまたはTSAバッファーを使用してセレノプロテイン溶液を調製します。タンパク質、低分子、および SYPRO Orange 色素を 384 ウェルプレートの適切なウェルに分注します。プレートを光学的に透明な接着フィルムで覆い、遠心分離機で1, 000gでプレートを1分間短時間回転させます。

次に、プレートをリアルタイムPCRマシンに置き、サンプルを摂氏20度で2分間保持し、その後、摂氏95度まで毎分温度を0.5度上昇させるようにプログラムします。RT PCR装置からデータをエクスポートし、温度に対する相対蛍光単位またはRFUを測定します。選択したソフトウェアを使用して、各融解曲線で測定された最高強度までのデータポイントを抽出してプロットします。

融解温度またはTm.The熱変性曲線は、マグネシウムイオンとATPの存在下で大腸菌SelOの熱安定性に4°Cの増加Escherichiaを示し、マンガンイオンとATPのために同じで12°C上昇を示すために、データのためのボルツマンシグモイドフィットで融解温度を決定します。しかし、UTPとのインキュベーション時に熱安定性に変化はなく、大腸菌SelOはUTPへの検出可能な結合を示さない可能性があることを示しています。タンパク質なしおよび色素なしのコントロールは、蛍光シグナルが低く、温度上昇に反応しませんでした。