シングルセルシーケンシングのための単離された胃腸マウス胚の細胞解離

遺伝子型が確認されたら、単離されたマウス胚の細胞解離に進みます。P200ピペットを使用して、新しい1.5ミリリットルのチューブに10%FBSを含む50マイクロリットルのDMEMを追加します。同じ遺伝子型の胚を新しいチューブにプールした後、氷の上に置きます。

プールされた胚がチューブの底に落ち着くのを待ってから、50マイクロリットルのDPBSを使用して胚を洗浄し、胚が落ち着くのを待ってから、胚を除去せずにできるだけ多くのDPBSを除去します。次に、プールした胚に100マイクロリットルのトリプシンを加え、摂氏37度でヒートブロック内で5分間インキュベートします。1.5ミリリットルのチューブを30秒ごとにそっとフリックして、細胞が解離するのを助けます。

5分後、10%FBSを含む300マイクロリットルのDMEMでトリプシンを中和します。.胚を100 Gで室温で4分間遠心分離します。得られた小さなペレットを10%FBSを含む40マイクロリットルのDMEMに再懸濁し、チューブを氷の上に置きます。

新しい1.5ミリリットルのチューブで、5マイクロリットルの細胞懸濁液と5マイクロリットルのトリパンブルーを混合し、混合物を上下にピペットで完全にピペットで動かします。混合物をスライドに移し、自動セルカウンターを使用して細胞数と生存率を決定します。最後に、メーカーのプロトコルに従って、マイクロ流体チップを使用したシングルセル分割に進みます。