クローン病患者由来のコロノイドを48ウェルプレートで拡張した後、コロノイドドームを損傷することなく、ウェルの端から培地を静かに取り出します。10マイクロモルのROC1と2つの阻害剤Y-27632を添加した300マイクロリットルの酵素解離試薬を各ウェルに加えます。P1000ピペットチップを使用して、ウェルの表面をこすり落とし、コロノイドドームを壊し、細胞懸濁液を上下にピペットで動かします。
細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。収集したコロノイドを摂氏37度の水浴で5分間インキュベートします。コロノイドを400 x gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、チューブ内に約1.2ミリリットルを残します。
次に、P1000ピペットの先端を懸濁液に入れ、チューブの底のすぐ上に保持し、懸濁液をチップにすばやく出し入れして、コロノイドを解離します。顕微鏡でチューブを観察して、結腸全体が残っていないことを確認します。そして、コロノイドの断片のサイズは約30〜40マイクロメートルです。
次に、15ミリリットルのチューブに10ミリリットルの氷冷オルガノイド洗浄培地を追加します。チューブを400 x gで3分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルの氷冷オルガノイド洗浄培地に再懸濁します。
懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、コロノイドフラグメントチューブとして標識します。混合後、サンプルの50マイクロリットルを新しいチューブに移し、細胞カウントチューブとして標識します。チューブを400 x gで3分間遠心分離します。
上清を取り除き、ペレットを500マイクロリットルの酵素解離試薬に再懸濁し、10マイクロモルのY-27632を補充します。シングルセルカウントチューブを摂氏37度のウォーターバスで5分間インキュベートします。400マイクロリットルに設定されたP1000ピペットを使用して、サンプルを迅速にピペットで移動します。
次に、サンプルを顕微鏡で観察して、単一細胞懸濁液を確認します。1ミリリットルのオルガノイド洗浄培地をシングルセルカウントチューブに加えます。次に、懸濁液を遠心分離し、上清を除去してから、ペレットを50マイクロリットルのオルガノイド洗浄培地に再懸濁します。
50マイクロリットルのトリパンブルーを加え、血球計算盤を使用して細胞を数えます。これに基づいて、結腸様断片チューブ内の細胞の濃度を計算します。新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで必要な量を遠心分離します。
次に、上清を取り除きます。ペレットを基底膜抽出物(BME)に再懸濁します。次に、インキュベート済みの96ウェルマイクロタイタープレートに、ウェルごとに10マイクロリットルのコロノイドBME溶液をリバースピペットで入れ、溶液を定期的に慎重に混合して、不均一な播種を防ぎます。
プレートを反転させ、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。20分後、200マイクロリットルの予熱したオルガノイド増殖培地をドームに重ね、3日間インキュベーションを続けます。
