クローン病患者由来のコロノイドを3日間インキュベートした後、プレートを傾けてウェルの端から培地を取り出します。2.5マイクロモルの蛍光細胞死色素を含むサイトカイン処理培地のウェルあたり200マイクロリットルを添加します。コロノイドを摂氏37度、二酸化炭素5%で必要な処理時間インキュベートします。
インキュベーション後、プレートをデジタル倒立落射蛍光顕微鏡のステージに移し、最大毒性条件のコロノイドが完全に溶解していることを確認します。伝達チャネルを使用して、SYTOX陽性細胞を持つコロノイドに焦点を当てます。次に、GFPチャネルに切り替えます。
光の強度と露光時間を調整して、背景を最小限に抑えながら蛍光信号を最大化します。最適化された画像設定を使用して、色素なしおよび最大毒性条件を観察し、サンプルが露出過多または露光不足にならないことを確認します。コロノイドドームを覆う固定グリッドパターンに従う視野を選択することにより、ランダムサンプリングアプローチを使用してコロノイドの透過画像とGFP画像を取得します。
画像をポータブルネットワークグラフィック形式で保存し、エクスポートします。画像データセット ファイルを ImageJ ツールバーにドラッグ アンド ドロップし、[画像]、[スタック]、および [イメージ → スタック] の順にクリックしてファイルを結合します。次に、[画像]、[タイプ]、[8ビット]の順にクリックして、画像スタックを8ビットファイルに変換します。
[フリーハンド選択] ツールをクリックし、透過画像上の関心領域を手動で選択します。次に、画像スタックを対応するGFPチャネル画像に切り替えます。ツールバーから、「分析と測定値の設定」をクリックします。
[Set Measurements]ダイアログウィンドウで、[Mean]グレー値にチェックを入れ、他のボックスはチェックを外したままにします。GFP画像を選択した状態で、「分析と測定」をクリックします。データセットが分析されたら、結果ウィンドウのすべてのデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
各条件のテクニカルレプリケート平均のグレー値の平均を計算します。各治療条件から未治療の状態の平均を差し引きます。次に、各治療条件を最大毒性条件のバックグラウンド減算平均で割ります。
処理後の細胞生存率を計算するには、1から正規化された値を差し引きます。与えられた方程式を使用して、摂動相互作用の係数を計算します。8時間後のコロノイドの透過蛍光オーバーレイ画像は、インターフェロンガンマとTNFアルファで処理されたコロノイドのみが蛍光シグナルに対して陽性であったことを示しました。
24時間後、インターフェロンガンマとTNFアルファで処理されたコロノイドは、蛍光シグナル陽性の大きな領域を示し、コロノイドの形態に明確な内訳を示しました。.8時間後の細胞死レベルは、BSA対照コロノイドでは低く、TNFα治療状態はわずかに増加しました。24時間後、インターフェロンガンマとTNFαで治療されたコロノイドは、最も高い細胞死レベルを示しました。
CPI値は、8時間でわずかなシナジー効果を示し、24時間で大幅なシナジー効果を示しました。これにより、インターフェロンガンマとTNFアルファとの間の時間依存的な相乗的相互作用が確認されました。
