まず、蓋がしっかりと固定されたガラス皿を取ります。皿にコットンボールを置きます。ドラフトの下で、綿球に3〜5ミリリットルのエチルエーテルを追加します。
すぐに皿を蓋で覆います。絵筆を使用して、ハエのバイアルからショウジョウバエの3番目の幼虫を拾います。1匹の幼虫を小さな開いた容器に移します。
容器をエチルエーテルを入れたガラス皿に入れ、すぐに皿をしっかりと閉じます。解剖顕微鏡を使用して、30秒ごとに幼虫の可動性を確認します。麻酔をかけた幼虫をガラス顕微鏡スライドに移します。
幼虫を昆虫の生理食塩水の滴に浸します。解剖顕微鏡下。生理食塩水の大部分をペーパーティッシュで取り除きます。
ジャイアントファイバーアブレーションの場合は幼虫の背側を上に、TTMnアブレーションの場合は腹側を上にして配置します。次に、ガラスカバースリップを幼虫にゆっくりと下げます。カバースリップの側面に生理食塩水を追加します。
スライドガラスとカバースリップの間のスペースを埋めます。ジャイアントファイバーアブレーションの場合は、解剖顕微鏡で高倍率下での脳の位置を確認します。脳が水平に横たわっていて、キューティクルを通して見えることを確認します。
脳を覆っている脂肪組織を変位させるには、鉗子を使用してカバースリップにわずかな圧力をかけ、カバースリップを左右に動かします。サンプルを多光子顕微鏡ステージに置きます。GFPフィルターを使用して、落射蛍光モードでサンプルを見つけます。
ジャイアントファイバーアブレーションの場合は、目的の細胞に焦点を合わせてから、2光子モードに切り替えます。レーザーを870ナノメートルに設定し、検出器のゲインを調整して、ガルバノスキャナーでGFP発現細胞を表示し、円形の関心領域を使用してアブレーションの領域を定義します。次に、ソフトウェアでアブレーションプロトコルの設定に進み、そのために、1フレームのアクイジション、スティミュレーションを順次設定し、続いて別のフレームのアクイジションを設定する。
刺激レーザー出力を低い値で開始し、刺激プロトコルを実行します。アブレーションが成功せず、細胞のみを漂白した場合は、レーザー出力を5%ずつ増やし、または一度に1つのループ数を増やし、プロトコルを再度実行します。細胞アブレーションが成功するまでこれを行います。
セルを正常にアブレーションした後、カバースリップを取り外します。絵筆でスライドから幼虫をそっと拾い上げ、幼虫をフードバイアルに移します。巨大繊維アブレーションサンプル中。
アブレーションは、脳のアブレーション側にGFP標識体細胞が存在しないことによって検証されました。TTMnアブレーション幼虫用。片側にTTMnがないことは、体細胞と樹状突起が欠落しているため、容易に認識できました。
