マウスCD4⁺ T細胞の初代ローディングとProtein G磁気ビーズの抗体コーティングによる局所Ca²⁺ イメージング

まず、マウスのリンパ節と脾臓から単離されたCD4陽性T細胞を採取します。200万から500万個の細胞を300gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、10マイクロモルのFluo-4 AMおよび20マイクロモルのFura Red AMを含む480マイクロリットルのT細胞培地にペレットを再懸濁します。Falconチューブをアルミホイルで覆い、暗所で室温で20分間細胞をインキュベートします。

次に、2ミリリットルのT細胞培地を細胞に加え、さらに30分間インキュベートを続けます。プロテインG磁気ビーズ懸濁液を穏やかに混合し、12.5マイクロリットルを新しいチューブに移します。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズが磁石に移動するようにします。

マグネットの反対側からストレージバッファーをそっと取り出して、取り出します。残りのストレージバッファーを削除するには、500マイクロリットルのPBSTを追加し、10秒間ボルテックスします。チューブを再び磁気スタンドに置き、バッファーを取り外します。

ビーズを抗体でコーティングするには、ビーズを7.5マイクロリットルのPBSTに再懸濁し、抗CD3と抗CD28を各5マイクロリットル追加します。室温で連続混合しながら30〜60分間インキュベートします。コーティングされたビーズを500マイクロリットルのPBSTで3回洗浄した後、磁気スタンドを使用して500マイクロリットルのカルシウムバッファーで洗浄した後、ビーズを200〜400マイクロリットルのカルシウムバッファーに再懸濁します。