蛍光顕微鏡を用いた初代マウスT細胞の細胞内レベルでのCa²⁺ マイクロドメインの検出

まず、ロードしたCD4 +細胞の10マイクロリットルを準備したスライドに置き、3〜5分間取り付けます。スライドに80マイクロリットルのカルシウム測定バッファーをそっと加えます。100X油浸レンズを選択します。

少量の浸漬油を塗布し、スライドを顕微鏡ステージに置きます。次に、明視野モードでフォーカスを調整します。互いに接触していないセルが最大10個ある視野を選択し、画像を取得します。

次に、1分後に10マイクロリットルの抗体コーティングされたビーズまたは覚醒剤を追加し、毎秒40フレームまたは可能な最大フレームレートを使用して合計3分間測定します。スライダーを使用して、ビーズと目的のセルとの間の接触時間を特定します。右側の[オプション]メニューで、[ビード接触]x、y、tを選択します。

画像の左側で、セルとビーズが接触するスポットを選択します。[セルの選択] を選択するには、内部のポイントをクリックします。このビーズによって刺激された細胞、できれば中央をクリックします。

[ADD bead contact]をクリックします。すべてのビーズの接触が定義されたら、[続行]ボタンをクリックして、追加のファイルに進みます 野生型細胞は、刺激後の最初の1秒以内に急速なカルシウムマイクロドメイン形成を示し、その後の15秒間で細胞全体に拡大しました。逆に、P2x4およびP2x7変異体細胞はカルシウムマイクロドメイン形成の減少を示し、P2x4変異体細胞も刺激前の基礎レベルが低くなりました。

マウスT細胞と同様に、ヒトCD4+T細胞のビーズ接触部位にカルシウムマイクロドメインが観察されました。