まず、1%ペニシリンとストレプトマイシンを含むヒトMSC培地を含む6ウェルプレートでMSCを培養します。次に、ARPE19 Mito-RFP細胞を細胞質膜中の細胞トレースバイオレットで標識します。これを行うには、20マイクロリットルのジメチルスルホキシドを細胞微量バイオレット試薬のバイアルに加え、使用直前によく混合します。
ARPE19 Mito-RFP細胞を所望の密度80〜90%まで増殖ローディング溶液を調製するには、予熱したDPBSで細胞微量バイオレットストック溶液を希釈します。次に、細胞から培地を取り出し、1ミリリットルのローディング溶液と交換します。細胞を摂氏37度で10分間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、ローディング溶液を取り出します。細胞をDPBSで2回洗浄した後、2ミリリットルの新鮮で完全な培地を加えます。次に、細胞を摂氏37度で少なくとも10分間インキュベートして、細胞トレースバイオレットが酢酸加水分解を受けるようにします。
次に、各ウェルに50マイクロリットルのDPBSを添加して、24ウェルプレートを調製します。カバーガラスをプレートに挿入し、1分間落ち着かせます。負圧を使用してウェルからDPBSを取り外し、カバースライドが皿の底に近づくようにします。
細胞密度が80〜90%に達したら、元の培地を取り除き、細胞をDPBSで一度洗浄し、トリプシンEDTA DPBS混合物を1ミリリットル加え、摂氏37度で3〜4分間インキュベートします。次に、6ウェルプレートを軽くたたいて、接着した細胞を剥離します。消化を終了するために、1ミリリットルの新鮮で完全な培地を追加します。
その後、ピペットガンですべての細胞を静かに再懸濁し、収集したすべての細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、細胞を200 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を1ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。
10マイクロリットルの細胞懸濁液を計数プレートに置き、計数します。MSCs細胞とARPE19細胞を24ウェルプレートに播種した後、顕微鏡で細胞を観察します。細胞が均一に分布するまでプレートを振ってください。
それらを培養物中で24時間インキュベートします。間接共培養については、24ウェルプレートのウェルあたり500マイクロリットルの培地中の10, 000 ARPE19細胞を参照してください。細胞が播種されたウェルにインサートを置きます。
ウェルあたり上部細胞チャンバー内の培地100マイクロリットルに10, 000個の間葉系幹細胞を播種します。
