MSC-Mito-GFPおよびARPE19-Mito-RFP共培養におけるTNT形成とミトコンドリア移動を解析するための細胞骨格染色

まず、共培養したMSC-Mito-GFP細胞とARPE19-Mito-RFP細胞を取り出し、24ウェルプレートから培地を取り出します。4%ポリホルムアルデヒドのウェルあたり500マイクロリットルですべての細胞を一度洗浄します。500マイクロリットルの新鮮な4%ポリホルムアルデヒドを追加し、サンプルを20分間固定します。

次に、固定液を取り出し、サンプルをDPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。PBSを除去した後、ブロッキング溶液のウェルあたり500マイクロリットルを追加し、室温で1時間インキュベートします。次に、ブロッキング溶液を取り外します。

ファロイジン染色液を調製するには、400倍保存溶液をPBSで1倍に希釈します。各ウェルに200マイクロリットルのファロイジン染色溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。次に、染色溶液を回収し、サンプルをDPBSで10分間洗浄します。

PBSを取り外した後、シリンジ針でカバーガラスを取り出し、風乾させます。スライドに少量の封入用剤を塗布し、スライド上のカバーガラスを慎重に裏返して、媒体が表面全体に均一にコーティングされるようにします。マニキュアで端を密封します。

トンネル状のナノチューブまたはTNT構造が観察され、類似した細胞タイプと異なる細胞タイプの両方の間に細胞間接続が確立されました。ミトコンドリアの移動は、MSC由来の緑色点線蛍光を含むARPE-19細胞およびARPE-19細胞由来の赤色点線蛍光を含むMSCにおいて観察された。超解像イメージングにより、TNTの形成とTNTを介した詳細なミトコンドリア移動が確認されました。

定量化により、MSCはARPE-19細胞と比較してミトコンドリアを提供する能力が有意に高いことが示されました。