マウス気管からの初代マウス気道上皮細胞の単離

まず、新たに調製した拡張培地を、滅菌したプロテイナーゼと抗生物質溶液をろ過し、滅菌した手術器具をバイオセーフティキャビネットの作業プラットフォームに並べます。ラットテールコラーゲンを100mm培養皿と24mmトランスウェルに加えます。滅菌のために、皿を紫外線の下で一晩開いたままにします。

安楽死させたマウスを75%エタノールに浸して滅菌します。鼻や口を浸さないでください。外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの下顎から腹腔までの表皮を切開します。

別の手術用ハサミと鉗子のセットを使用して、両側の甲状腺を引き裂き、気管、周囲の筋肉組織、および食道の間の接続を取り除きます。次に、胸部を慎重に切り込み、鉗子を使用して胸腔を深く掘り下げます。肺全体を切除し、気管の端を見つけます。

甲状軟骨から気管気管支枝までの気管を切り出し、4種類の抗生物質が入ったプレコールド拡張培地に入れます。チューブを振って、気管の表面からできるだけ多くの血液を洗い流してから、氷の上に置きます。次に、気管を4つの抗生物質を含む低温前のPBSに移します。

外科用ハサミと鉗子を使用して、気管の表面から血栓やその他の組織を取り除き、それらを1平方センチメートルのサイズに切ります。気管組織を摂氏37度のプロテイナーゼ溶液でインキュベートします。40分後、チューブを数回揺らし、40ミクロンのセルストレーナーを使用して残りの組織を取り出します。

刻んだ気管を5ミリリットルの拡張媒体を含むストレーナーですすいでください。気管懸濁液を摂氏4度で5分間400Gで遠心分離し、ペレットを8ミリリットルの拡張媒体に再懸濁します。トリパンブルーと血球計算盤を使用して生存細胞を数えます。

ラットテールコラーゲンでプレコートされた100mm皿にP0細胞懸濁液をプレート化します。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で培養します。