一次マウス気道上皮細胞が80%の密度に達したら、ラットテールコラーゲンでコーティングされたスライドガラス上に細胞を座らせます。次に、パラホルムアルデヒドを加えて細胞を12時間固定します。スライドをPBSで3回、各5分間洗浄し、3%ウシ血清アルブミンおよび0.1%Triton X-100のPBS溶液と1時間インキュベートします。
スライド上に1〜500の希釈で抗パンサイトケラチン抗体を添加し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、スライドをPBS溶液でそれぞれ5分間3回洗浄した後、暗所で1〜1,000の希釈で二次抗体と2時間インキュベートします。スライドをPBSで洗浄した後、DAPIを1〜1, 000の希釈で加え、15分間インキュベートします。
スライドをPBSで5分間一度洗います。蛍光顕微鏡でスライドを観察し、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの発現パターンを比較します 剥離および遠心分離後、P2期細胞を適切な容量の増殖培地に再懸濁します。1ミリリットルの細胞懸濁液をTranswellポリカーボネートメンブレンインサートの頂端チャンバーにピペットで移します。
1.5ミリリットルの増殖培地をトランズウェルの基底コンパートメントに加えます。コンフルエントに達するまで、細胞を摂氏37度でインキュベートします。以下の成分を使用して、50ミリリットルの完全分化培地を調製します。
1本のタバコを12.5ミリリットルの分化培地で泡立て、0.22ミクロンの注ぎフィルターでろ過してタバコの煙抽出物またはCSEを調製します。実験とCSEのバッチ間の標準化を確実にするために、分光光度計で320ナノメートルの吸光度を測定します。次に、Transwellsの頂端室と基底室から膨張培地を取り出します。
適切な濃度のCSEを含む分化培地を添加して、初代マウス気道上皮細胞を28日間刺激します。インキュベーション中は、週に2回、頂端チャンバーをPBSで洗浄し、基底チャンバー内の培地をCSEを含む新たに調製した分化培地と交換します。マウス気道上皮細胞は、28日間で気液界面で首尾よく分化しました。
繊毛細胞および杯細胞の存在は、繊毛マーカー、アセチル化αチューブリン、および杯細胞マーカームチン5ACの免疫蛍光アッセイによってそれぞれ実証されました。CSE濃度を変化させた24時間後の細胞生存率は、濃度が6%を超えると上皮細胞が減少することを示しました長期刺激下での細胞活性は、2%4%および6%CSE濃度で有意な細胞死を示さなかった。しかし、膜貫通抵抗と剥離細胞の変化が認められました。
さらに、マウスの気道上皮細胞培養物をCSEに慢性的にばく露すると、分化細胞および繊毛細胞の全体的な減少が認められました。
