まず、麻酔をかけたマウスを定位固定装置の上に置きます。手術用ハサミを使用して頭皮の正中線に沿って連続的に切開し、頭皮の一部を切り取って頭蓋骨の表面を露出させます。マイクロドリルで指定した領域に開頭術を行い、境界として4つのポイントを設定します。
脳組織が見えるようになったら、穴あけをやめてください。コントロールパネルを使用して、インジェクターが80ナノリットルのウイルスを注入するように設定します。コントロールパネルの[Inject]ボタンをクリックして、ウイルスを毎秒1ナノリットルの流量で歯状回に注入します。
脳組織を吸引するには、鈍い針の先端を脳組織の真上で回転させ、吸引を促進するために優しく押します。吸引中は冷たい生理食塩水で継続的にすすいで、脳の明確な視界を維持します。吸引の深さを監視するために、組織の特徴を綿密に観察します。
皮質組織は淡いピンク色です。その下の脳梁は白い線維組織として現れます。そして、海馬のCA1層は濃い赤と灰色です。
組織の表面が滑らかになり、CA1の広い領域が露出したら、吸引を停止します。グリンレンズに取り付けられているホルダーをドリル穴の上に移動します。グリーンレンズが脳組織の表面に接触したら、Z軸をゼロに設定します。
グリンレンズを背側腹軸マイナス1.32ミリメートルの穴に挿入します。ホルダーを5〜10分間放置します。次に、ホルダーを上げて、生理食塩水で穴をすすぎます。
針を使って、グリンレンズの周りに紫外線樹脂を塗布します。紫外線で15秒間照らして、樹脂が固まることを確認します。ホルダーをグリンレンズから慎重に取り外します。
露出した頭蓋骨全体を紫外線樹脂で覆います。頭蓋骨のヘッドプレートを適切な位置に置きます。頭蓋骨と頭部プレート全体を紫外線で15秒間照らします。
露出したグリンレンズを3Dプリントされた保護キャップで覆います。M1.6ネジを使用してキャップをヘッドプレートに固定します。Miniscope制御ソフトウェアの電源を入れ、[構成の選択]をクリックします file 。
次に、vscodeを選択し、次に[ユーザー構成ファイル]を選択します。次に、[実行] をクリックします。次に、LEDの電源ボタンをスライドさせて明るさを調整します。
フォーカス調整ボタンをスライドして、ゼロに近い値を設定します。ベースプレートをミニスコープに取り付け、ミニスコープの位置を再調整して、良好な視野を得る view 良好なイメージング品質。ミニスコープベースプレートの周りに義歯ベース材料の1層目を慎重に塗布します。
セメントの1層目が固まったら、ベースプレートからヘッドプレートに2層目のセメントを塗布します。すべての義歯ベース材が固まったら、止めネジを緩め、ミニスコープをベースプレートから取り外します。ベースプレートキャップをベースプレートに入れて露出したグリンレンズを保護し、止めネジを締めます。
イメージング後、イメージングデータをAVIからHDF5形式に変換します。非リジッドモーション補正を適用し、モーション補正されたムービーをダウンサンプリングします。ダウンサンプルデータに抽出を適用して、シングルセルシグナルを同定します。
次に、セルチェックを適用し、潜在的なセルを手動で選択します。セルチェックウィンドウを閉じる前に、[データの保存]をクリックします。最後に、データファイルを保存します。
失敗したin vivoカルシウムイメージングでは、イメージング視野に活性細胞は観察されませんでした。in vivoでのカルシウムイメージングに成功したところ、明らかな血管のない活性細胞は10個未満でした。目に見える血管を持つ50以上の活性細胞。
そして、透明な血管を持つ何百もの活性細胞。成功したin vivoカルシウムイメージング記録から抽出された個々の細胞を、代表的なカルシウムの痕跡を示して視野に重ね合わせました。GCaMP6F発現の位置とニヤリと光るレンズの軌跡をマウス脳スライスで確認しました。
