ヒト網膜オルガノイドの作製とミクログリアとの共培養による疾患モデリングと薬物スクリーニング

まず、ヒト胚性幹細胞からヒトミクログリアを採取し、56日目に採取します。レチナールオルガノイドの誘導のために、細胞密度が80から90%に達するまで幹細胞培地でヒト胚性幹細胞を培養し、培養細胞にウェルあたり1ミリリットルのディスパーゼを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。ディスパーゼを除去した後、各ウェルに1ミリリットルのミディアムDを追加します。

セルを細かく切ります。10マイクロリットルのピペットで、すべての細胞片と培地を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに静かに集めます。チューブを200 x gで5分間遠心分離します。

上清を取り除いた後、細胞を200マイクロリットルの冷たいマトリックスに穏やかに再懸濁します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブをインキュベーターに20分間移します。インキュベーター内で20分後、マトリックスは固化します。

10センチの皿に15ミリリットルのミディアムDを用意し、マトリックスをミディアムDで再懸濁し、ペトリ皿を静かに振る。皿をインキュベーターに5日間置きます。12日目に、培地を3ミリリットルのディスペーゼと交換します。

5分後、ディスパーゼを吸引し、15ミリリットルの培地E.12日目に採取したミクログリアを消化した網膜オルガノイドに導入します。19日目に、プレートを静かに回転させてオルガノイドを皿の中央に凝集させ、培地Eを培地Fに交換します。30日目までに、ミクログリアと共培養したレチナールオルガノイドは、有意なGFP自家蛍光を示し、ミクログリアの存在を示しました。

共培養した網膜オルガノイドは、光受容体マーカーCRXおよびミクログリアマーカーIBA1に対して明確な免疫蛍光シグナルを示しました。