まず、熱帯熱マラリア原虫のソルビトール同期リングステージ寄生虫を入手します。50ミリリットルの2x cytomixバッファーを調製し、滅菌水で1対1に希釈します。次に、100 μリットルの充填リングステージに寄生したRBCを5 mLの1X cytomix bufferで2回洗浄し、室温で3分間994Gで遠心分離します。
バッファーを取り除いた後、各プラスミドを50μgずつ細胞に加え、続いて適量の2倍バッファーを加えます。1xバッファーで容量を400マイクロリットルに調整してから、調製した溶液をトランスフェクションごとに0.2センチメートルのキュベットに移します。次に、細胞を慎重にエレクトロポレーションします。
エレクトロポレーション後、T25フラスコ内の完全なRPMI培地と細胞を混合し、インキュベートします(総容量15ミリリットル)。次に、トランスフェクションした寄生虫を50ミリリットルの円錐管に994Gで3分間遠心分離します。上清を取り除いた後、寄生虫を10ミリリットルの不完全なRPMIで洗います。
それらを新鮮な完全なRPMIで2日間培養し、24時間後に培地を補充します。48時間後、各フラスコから完全なRPMIを取り出します。薬物を添加した完全なRPMIで培養物を再懸濁します。
T75フラスコで培養物を400マイクロリットルの新鮮な赤血球とともに2週間インキュベートします 14日目に、トランスフェクションした培養物の200マイクロリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。チューブを500Gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引した後、細胞をスライドに移し、その上に別のスライドを45度の角度で置いて塗抹標本を作ります。
メタノール固定後、スライドをギムザ染色液に20分間浸漬します。スライドを流水で洗い、十分に乾かします。液浸油を塗布した後、光学顕微鏡で100倍の倍率でスライドを観察します。
寄生虫が視覚化されたら、培地を毎日2〜3日間補充します。
