真菌およびウイルス性病原体に対する抗原特異的宿主免疫を決定するためのフローサイトメトリーおよびサイトカイン分析のための全血サンプルの調製

フローサイトメトリーのサンプル調製を開始するには、全血サンプルをブレフェルジンAで入った刺激チューブをインキュベーターから取り出します。ブレフェルジンA.サンプルを新しい15ミリリットルの遠心分離管に移す各刺激チューブに0.5モルEDTA溶液の0.5マイクロリットルを追加します。次に、1ミリリットルの赤血球溶解バッファーを各刺激チューブにピペットで注入し、すすぎます。

バッファーと細胞懸濁液を同じ遠心分離チューブに移します。チューブを600gで7分間遠心分離し、上清を慎重にピペットで排出します。次に、赤血球溶解バッファーをペレットに加え、再懸濁します。

サンプルが透明になるまで室温で、または最大6分間インキュベートします。チューブを600gで7分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットにHBSSを1ミリリットル加えます。

細胞懸濁液を2ミリリットルの反応チューブに移します。次に、チューブを400 gで5分間遠心分離します。フローサイトメトリー染色を行う前に、上清を捨ててください。

ブレフェルジンAを含まない刺激チューブからサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブを2, 000 gで20分間遠心分離します。次に、上清を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに慎重にピペットで移します。

上清をすぐに分析しない場合は、サンプルを摂氏80度で凍結保存します。凍結サンプルを使用する場合は、分析前に7, 000 gを超える速度で上清を再度遠心分離して解凍します。サイトカインアッセイプロトコルで要求されるサンプルの事前希釈を行います。

細胞ペレットを1ミリリットルのRNA保護バッファーに再懸濁します。その後のRNA単離のために摂氏80度で凍結保存します。あるいは、細胞ペレットを700マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁して、RNAを直ちに分離します。