SUMO融合タグを用いたテロメアDNA結合タンパク質TRF2の発現と精製

大腸菌BL21 DE3細胞の形質転換を開始するには、コンピテント細胞懸濁液の50マイクロリットルアリコートを氷上で解凍します。コンピテントセル懸濁液にpET 28a Sumo TRF2プラスミドのDNAを1マイクロリットル加え、チューブを静かに渦巻かせて懸濁液を混合します。形質転換後、100マイクロリットルの細胞懸濁液を、1ミリリットルあたり50マイクログラムのカナマイシンを含むルリアベルタニまたはLB寒天プレートに広げます。

細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、形質転換細胞のコロニーを選び、5ミリリットルのLB培地で培養し、1ミリリットルあたり50マイクログラムのカナマイシンを補充します。220 RPMで振とうしながら、摂氏37度で18時間インキュベートします。

インキュベーション後、1ミリモルのIPTGを最終濃縮として培養を誘導します。20°Cで17時間インキュベートし、タンパク質の発現を促進します。粗タンパク質抽出物をローディングバッファーとともにSDS-PAGEゲルにロードします。

サンプルを最初に100ボルトで30分間分析し、次に120ボルトでトリス-グリシンバッファーで50分間分析します。その後、クマシーブルーで染色し、タンパク質の発現を可視化します。タンパク質精製のために、粗タンパク質抽出物を38, 000Gで40分間摂氏4度で遠心分離し、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを通して上清をろ過します。

ろ過した上清を、結合バッファーの予め平衡化したニッケルカラムにロードします。結合バッファーでカラムを洗浄し、調製したイミダゾールグラジエントでタンパク質を溶出し、それぞれ1ミリリットルの12個の画分を収集します。グリセロールを最終濃度50%まで濃縮し、バッファー交換したタンパク質に添加して保存します。

大腸菌におけるTRF2の発現は、SDS-PAGEが示すように、誘導前後でTRF2に対応する明確なバンドが現れることに成功しました。