まず、テロメア制限断片DNAを含む7つのHeLa細胞株の累乗に1回10を遠心分離し、1,000gで3分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。SDSプロテイナーゼKおよび塩化ナトリウム処理後、細胞懸濁液を16,900gで10分間遠心分離する。
上清を新しい遠心チューブに移し、浮遊する脂質や沈殿物を避けて、等量のイソプロパノールを追加します。高速で遠心分離し、ペレットを500マイクロリットルの70%エタノールで洗浄します。DNAペレットを乾燥させた後、475マイクロリットルのTEバッファーに慎重に再懸濁し、チューブの底を軽くたたいて穏やかに混合します。
次に、1ミリリットルあたり10ミリグラムのRNAsayを25マイクロリットル加え、ペレットが完全に溶解するまでチューブを軽くたたきます。次に、1/10容量の3モル酢酸ナトリウムと2容量の冷100%エタノールを加え、チューブを摂氏マイナス80度に2〜3時間置きます。遠心分離と70%エタノール洗浄後、DNAペレットに100マイクロリットルのTEバッファーを加え、チューブを軽くたたいて混合し、摂氏4度で2時間置いて完全に溶解します。
DNA消化には、4マイクログラムのゲノムDNAと1マイクロリットルのCviAII、2マイクロリットルの10倍消化バッファー、および水を組み合わせて、総容量20マイクロリットルにします。混合物を摂氏25度で12時間インキュベートします。サーマルサイクラーで、混合物を摂氏75度で3分間加熱します。
次に、摂氏0.1度に達するまで、30秒ごとに温度を摂氏25度下げます。洗浄して乾燥させた後、底蓋スリップを20マイクロリットルの0.1%ニトロセルロースでコーティングし、参照ビーズを追加します。カバースリップを摂氏100度で4分間焼きます。
フローセルサンドイッチを組み立てます。そして、摂氏85度で加熱した後、パラフィルムがチャネルを密閉するまで、2本の綿棒を使用してアセンブリをマッサージします。10マイクロリットルのM-270ビーズを磁石を使用して50マイクロリットルの作業緩衝液で5回洗浄します。
洗浄後、消化したゲノムDNAの上にビーズを1.5ミリリットルの遠心チューブに加えます。チューブを数回静かにフリックして、ビーズとDNAサンプルを混合します。混合物を氷の上に1時間放置します。
インキュベーション後、混合物を500マイクロリットルの作業緩衝液で磁石を使用して3回洗浄し、洗浄の間隔を空けてビーズを引き下げます。サンプルを作業バッファーに再懸濁し、混合物の30マイクロリットルをフローセルにロードします。30分後に結合されていない磁気ビーズを洗い流します。
対物レンズの上にフローセルを置いた後、垂直に配置された5mm立方体の磁石のペアを選択し、マグネットホルダーを磁気ピンセットの光路のx軸に合わせます。グラフィカルプログラミングソフトウェアを起動し、磁気ピンセットのコントローラーを接続します。視野を調整して、フローセルの下部にある参照ビードを見つけ、対物レンズをわずかに調整して、参照ビードが明確な屈折リングを示すようにします。
フォースランプアッセイの運動運動を制御するスクリプトを MATLAB で記述します。スクリプトをグラフィカルプログラミングソフトウェアにインポートして、単一分子実験をテストします。ゆっくりとした流速で、200マイクロリットルの10ナノモルTRF1をフローセルにロードします。
30 分間のバインド後、力の負荷率が 1 秒あたりプラス/マイナス 1 ピコニュートンの力のランプ実験のスクリプトを選択します。データファイルに名前を付けて、実験を実行します。ゲノムDNAの完全性は、アガロースゲル電気泳動を用いて確認され、得られたTRSは、さまざまなヒト細胞株にわたって一貫した長さを示しました。
TRSのテロメアリピート配列はサザンブロッティングによって検出され、明確なハイブリダイゼーションシグナルが示されました。フォースランプアッセイによるフォースエクステンションカーブは、伸張中にジグザグパターンを示し、タンパク質DNA相互作用の切断を示しています。テロメアDNAタンパク質複合体の解離速度論は、力と解離速度との間に線形関係を示しました。
さらに、ヒト細胞由来のテロメアDNAの長さの不均一性により、さまざまな長さのテロメアにおけるループ形成メカニズムが調査されます。
