まず、新たに調製したフィルター滅菌ブロッキングバッファーである10X反応バッファー1と2を作業プラットフォームに配置します。2.5ミリリットルのブロッキングバッファーと5ミリリットルの超純水が入ったオープンチューブをデシケーターに入れ、真空下で脱気します。15分後、圧力を緩め、チューブを取り外します。
調製したビオチン-PEGフローセルアセンブリを顕微鏡ステージに置き、両端に接着剤パテで固定します。フローセル出口チューブを針でシリンジポンプに接続します。対物レンズヒーターを摂氏30度に切り替えます。
チューブ内の1〜2ミリリットルの脱気水を、フローセルの近くにある別の接着剤パテに固定します。インレットチューブをチューブに底に達するまで挿入し、チャネルに水を流します。流量を増やして、インレットチューブの近くに閉じ込められた気泡を取り除きます。
100マイクロリットルの脱気ブロッキングバッファーを、1ミリグラム/ミリリットルのストレプトアビジンの20マイクロリットルアリコートに加えます。開いたチューブを接着剤のパテに取り付けます。インレットチューブを水からストレプトアビジンに移し、毎分40マイクロリットルの速度で2分間流れを開始します。
5分後、ブロッキングバッファーで過剰なストレプトアビジンを洗い流します。25ナノモルのSYTOX Orangeを含むブロッキングバッファーで希釈したビオチン化DNAの流れ。532ナノメートルレーザーによるライブビューで、DNAが表面につながっている様子をリアルタイムで観察します。
表面上のDNAの所望の密度が達成されたら、25ナノモルSYTOXを含むブロッキングバッファーに流して、遊離DNAを洗い流します。次に、フローおよびビオチン化抗ジゴキシゲニン抗体を、25ナノモルのSYTOX Orangeを含むブロッキングバッファーで希釈しました。ビオチン化抗ジゴキシゲニン抗体とSYTOX Orangeをブロッキングバッファーで洗い流してください。
50マイクロリットルのATP-γ-Sがフローセルに混ざります。精製したCMGヘリカーゼを30マイクロリットルのATP-γ-S混合物中の約100ナノモルの最終濃度に加え、毎分20マイクロリットルで20マイクロリットルで20マイクロリットルに流します。15分間インキュベートします。
次に、ATP RPA混合物を毎分40マイクロリットルで80マイクロリットルに流します。各レーザーを50〜100ミリ秒の露光で使用し、488ナノメートルのレーザーでEGFP RPAを視覚化して取得し、次に640ナノメートルのレーザーでCMGを取得します。最後に、532ナノメートルレーザーでSYTOX Orange染色されたDNAを視覚化し、取得します。
DNAのCMGヘリカーゼ巻き戻しは、経時的に追跡された黄色のRPAの線形成長によって視覚化され、巻き戻されたDNA鎖が示されました。一本鎖DNA損傷は、データ内の完全な痕跡が少ないことから実証されるように、観察された巻き戻しイベントの成功数を減らしました。
