ミトコンドリアを分離するには、麻酔をかけた首を切ったラットを氷の上で腹臥位に置きます。心臓を露出させた後、大動脈を大動脈基部の約4〜6ミリメートル上、頸動脈分岐点より下に切断します。大動脈をカニューレに流し、冠状動脈の血液が取り除かれ、臓器が白くなったように見えるまで、重力依存の圧力ヘッドを使用して氷のように冷たい心臓麻痺溶液で心臓を灌流します。
心房、軟骨弁組織、脂肪組織を解剖して、心室心筋を分離します。鋭利な外科用ハサミで組織を細かく刻み、ピースが約1立方ミリメートルになるまで切ります。ミンチ組織を予め冷却した遠心分離チューブに移し、プロテアーゼ溶液を含むスピン1およびスピン2を標識します。
氷冷分離バッファーを最終容量25ミリリットルに加えます。電動ハンドヘルドローターステーターホモジナイザーを使用して、組織を18, 000 RPMで氷上に20〜25秒間分散させます。均質化された組織を8, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。
上清を捨てます。そして、ペレットを5ミリリットルの分離緩衝液で穏やかにすすぎ、残留プロテアーゼを除去します。すすぎ液を捨てた後、氷冷分離バッファーを最終容量25ミリリットルまで加えます。
その後、渦巻きしてペレットを再懸濁します。組織ホモジネートを800 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。ミトコンドリアを含む上清を、あらかじめ冷やしたラベル付きの50ミリリットルチューブに静かに注ぎます。
次に、上清を8, 000 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを含むミトコンドリアを保持します。糸くずの出ないワイプを使用して、ペレットを乱さずにチューブの内壁から余分な上澄みを吸収し、チューブを氷の上に置きます。
チューブの底に80マイクロリットルの氷冷分離バッファーを追加し、マイクロピペットを使用してミトコンドリアを穏やかに再懸濁します。再懸濁したら、ミトコンドリアを事前に冷却した標識マイクロ遠心チューブに移します。バイソン速度論的酸タンパク質アッセイを用いて、ミトコンドリアタンパク質濃度を測定します。
あらかじめ冷却したマイクロ遠心チューブで、ミトコンドリアストックをアイソレーションバッファーで目的の使用濃度に希釈します。ミトコンドリア分離株の生存率と品質をテストするには、2.3ミリリットルの呼吸緩衝液をオキシグラフチャンバーにロードします。酸素消費信号を摂氏37度で約10分間、またはレートがゼロに近づくまで平衡化させます。
平衡化したら、ストッパーを押し下げ、余分なバッファーを吸引します。10マイクロリットルのハミルトンシリンジを使用して、1ミリモルのEGTAを追加し、オキシグラフの呼吸緩衝液中の残留カルシウムをキレート化します。.呼吸を促進するには、5ミリモルのピルビン酸ナトリウムと1ミリモルのアルリンゴ酸を緩衝液に加えます。.
次に、希釈したミトコンドリアのボーラスを加え、5分間呼吸をします。5分経過したら、500マイクロモルADPのボーラスを追加して、状態3の呼吸を開始します。呼吸制御比を計算するには、状態 3 の最大酸素消費量を、状態 2 の ADP を追加する直前の酸素消費量で割ります。
ADP添加直後に酸素消費量の急速な増加が観察され、単離された心臓ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の開始が成功したことを示しています。モルモット、Sprague-Dawleyラット、およびFriend白血病ウイルスBマウスの心臓ミトコンドリアは、高い呼吸制御率を示し、良好なミトコンドリア分離品質を示しました。Sprague-Dawley Ratsの肝臓と腎臓のミトコンドリアも、分離の成功を支持する許容可能な呼吸制御比を示しました。
HEK293細胞は、許容閾値を超える呼吸制御比値を示し、これらの細胞からのミトコンドリア単離の品質を確認しました。
