まず、ゲル電気泳動の調製に必要な試薬を作業プラットフォームに置きます。トリス/ホウ酸塩/EDTAまたはTBEをアガロースに加え、溶液を電子レンジで加熱します。次に、0.4〜0.5%のアガロースをキャスティングトレイに注ぎ、一次元のアガロースゲルを調製し、1時間固化させます。
固化後、ゲルの左端に対して最初の3センチメートル以内にラダーをロードします。次に、制限酵素で消化したDNAサンプルをロードし、各ペア間の距離を3cm確保します。ゲルをTBEで0.85ボルト/センチメートルで19〜24時間泳動し、中間体をサイズごとに分離します。
翌日、緩衝液からゲルを取り出します。はしごを含むゲルの最初の3センチメートルを切除します。1ミリリットルあたり0.3マイクログラムの臭化エチジウムを含むTBEでゲルセグメントを10〜15分間染色します。
次に、ゲルドキュメンテーションシステムを使用してはしごを視覚化します。アガロースゲル上で、推定位置に1.3センチメートルを加えて、Aの値を生成します。次に、値Aから7.5センチメートルを引くと、値Bが得られます。定規を1次元のゲルに合わせ、値AとBで水平にカットします。次に、各サンプル用に確保された3センチメートルのスペースを垂直にカットします。新しいキャスティングトレイで、セグメントを時計回りに回転させ、サンプルウェルの位置に置きます。
2次元アガロースゲルをTBEで1〜1.3%の濃度で、臭化エチジウム1ミリリットルあたり0.3マイクログラムで調製します。ゲルを加熱し、約55°Cに冷却したら、回転した1次元セグメントに注ぎます。ゲルが固まるまで1時間待ちます。
固化後、臭化エチジウム1ミリリットルあたり0.3μgのTBEを含むチャンバーにゲルを移し、30分間平衡化させます。ゲルを覆い、摂氏4度で4.23ボルト/センチメートルで9〜10時間実行します。2次元ゲルをチャンバーから取り出し、0.24モルの塩酸溶液でDNA断片を10分間脱精製し、穏やかに揺さぶります。
ゲルを脱イオン水ですすぎ、0.4モルの水酸化ナトリウムに10〜15分間浸します。次に、2枚の長いクロマトグラフィー紙をガラスシートを横切って垂直に折り、容器に伸ばします。サザンブロットを組み立てるには、容器に1リットルの0.4モル水酸化ナトリウムを入れます。
容器全体に長いガラスシートを揃えます。紙の上部を水酸化ナトリウムで濡らし、表面の下の気泡を慎重に取り除きます。3枚のクロマトグラフィー紙を水酸化ナトリウムに浸し、フォルダー紙の上に置きます。
気泡を取り除きます。2次元ゲルを逆さまにして、クロマトグラフィーペーパーの上に置きます。正に帯電したナイロンメンブレンを脱イオン水で濡らし、ゲルの上に置きます。
次に、脱イオン水で濡らした3枚のクロマトグラフィーシートをメンブレンの上に置きます。容器内の露出した水酸化ナトリウムをプラスチックラップで覆い、蒸発を防ぎます。高さ0.3〜0.5メートルのナプキンまたはペーパータオルのスタックをしみの上に置きます。
ブロット全体を重りで圧縮して、キャピラリーの密集性を高め、DNAをメンブレンに移すために2日間放置します。
