農業浸潤植物における病原体局在を調査するための標的タンパク質の共焦点顕微鏡法

まず、目的のベクターを持つAgrobacterium tumefaciens細胞が浸潤したNicotiana benthamiana植物を入手します。タンパク質の局在化研究では、浸潤後、異なる時点で2つの植物から2枚の葉を収穫します。ブレードを使用して、浸潤ゾーンを静脈から離れたスライスに切断します。

アバキシャル面を上にして組織サンプルを顕微鏡スライドの中央にある滅菌水滴の上に置きます。スライドをカバーガラスで覆い、気泡が閉じ込められないようにします。浸潤領域の自己蛍光タグの蛍光シグナルをレーザー走査型共焦点顕微鏡で可視化します。

少なくとも 2 つの独立した生物学的レプリケートを使用して、各条件について 20 枚の画像を収集します。細胞末梢でのシグナルの診断的点状外観に基づいて、試験したタンパク質の杢形質局在をスコアリングします。TVCV MP-EGFP および PDL5-EGFP タンパク質は、plasmodesmata への明確な点状局在を示しました。

PDCB1-EGFPは、浸潤後の初日にplasmodesmataと小胞体の両方に局在を示しました。MPとPDLP5はどちらも浸潤後1日目にplasmodesmataに蓄積し始め、2日目に最大強度に達し、5日間安定していました。PDCB1は、3日目まで強力な小胞体局在を示し、その後、より少ない細胞で原形質局在が見られるようになった。