多能性幹細胞(PSC)の心臓分化および免疫蛍光染色

多能性幹細胞またはPSCを6ウェル培養プレートに保持し、顕微鏡で細胞密度を確認します。心筋細胞またはCMの分化には、PSC調製培地の96ウェル培養プレートにPSCを播種します。心分化のステージ 1 で、PSC が 80 から 90% のコンフルエンシーに達したら、培地を 2 から 20 マイクロモルの CHIR を持つ CM 分化培地に切り替えます。

CHIR治療の24〜48時間後、培地を新鮮なCM分化培地に交換します。ステージ 2 または 3 日目に、培地を CM 分化培地に交換し、5 日目まで培養中の 5 マイクロモル IWR1 を補充します。次に、培地をCM分化培地に変更し、PSCが心前駆細胞またはCPCに分化する6〜7日目まで保持します。

10日目または12日目に、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。染色時には、細胞を透過処理溶液で室温で30分間処理します。サンプルをCTNT一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。

次に、1%ウシ血清アルブミンを含むPBS中の二次抗体でサンプルを摂氏37度で1時間処理します。細胞から二次抗体を取り除いた後、Hoechstで核を室温で5分間染色します。次に、PBSを使用して細胞を3回すすぎ、乾燥を避けるためにウェルあたり100マイクロリットルのPBSを追加します。

生細胞培養をサポートする自動顕微鏡を使用して、分化のさまざまな段階の明視野およびCTNT免疫蛍光画像を収集するには、ソフトウェアを開いて新しい実験デザインを作成します。イメージングには、5X対物レンズと2X2ブレンドを選択します。チャンネルメニューで、明視野用のTL明視野チャンネルと免疫蛍光イメージング用のAF 488およびH 33 42チャンネルを追加します。

イメージング設定のライトパスを変更します。Zスタックメニューで、スキャン時のスライス数と間隔を設定します。ナビゲーションとタイルウィンドウで、キャリアごとにタイル領域を設定し、1 つのウェルに対して 25 個のタイルを 5 列の 5 行に設定します。

画像を取得するためには、まず細胞培養プレートをサンプルトレイに入れ、トレイを顕微鏡内にロードします。サンプルが生細胞で構成されている場合は、加熱システムと二酸化炭素ポンプを開いて、培養に適した条件を摂氏37度、二酸化炭素5%に保ちます。プリセットの実験的なプロジェクトを開きます。

タイルメニューを開き、プレートの位置を手動で調整します。ナビゲーションとタイル ウィンドウで、必要なウェルを選択し、[作成] をクリックして、これらのウェルのタイル領域を構築します。タイル メニューの [Verify tile Regions] をクリックし、オート フォーカスを実行してすべてのウェルを確認します。

次に、各ウェルの焦点を手動で修正します。実験開始ボタンをクリックし、自動イメージングを待ちます。通常、96ウェル培養プレート全体をスキャンするには約1.2時間かかります。

処理フレームワークで、画像のエクスポートを選択し、非圧縮の TIFF 形式または PNG 形式のファイルタイプを選択して適用します。