まず、冷凍された熱ストレスを受け、未処理の5日齢のシロイヌナズナの苗木であるコロンビア-0を液体窒素容器に集めます。ホモジナイザーを使用して苗を粉末に1分間挽きます。次に、500マイクロリットルのポリソーム抽出バッファーをチューブに加えます。
チューブを反転させてボルテックスし、サンプルを混合します。抽出溶液を12, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清を100マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、粒子を含まない透明な抽出溶液を得ます。
ろ過した上清を事前に調製したショ糖勾配にロードし、平衡に達するまで待ちます。次に、スイングバケットローターを使用して、210、000Gで摂氏4度で最大の加速速度と減速速度で3.5時間グラジエントを超遠心分離します。非ポリソームRNAとポリソームRNAは、対応するショ糖勾配溶液中での密度に基づいて分離されます。
70%スクロース、10%グリセロール、および0.02%ブロモフェノールブルーからなるマイクロボリュームシリンジポンプ用のチェイス溶液を準備します。溶液を30〜40分間完全に混合します。追跡溶液をグラジエントに注入した後、ソフトウェアを使用して、密度グラジエントフラクショネーターを制御します。
次に、脱イオン水で機械を校正します。超遠心分離後、チューブを密度勾配フラクショネーターに置きます。チューブピアスシステムを使用して、チューブをシリンジポンプと紫外線検出器に接続します。
密度勾配フラクショネーターをソフトウェア制御モードにリモートで切り替えます。微量シリンジポンプの注入流量を毎分3ミリリットルに設定します。フラクショネーターを使用して254ナノメートルの光学密度を測定することにより、ポリソームプロファイルグラフを取得するプロセスを開始します。
ポリソームプロファイル測定に基づいて、非ポリソームRNA画分とポリソームRNA画分を別々に収集します。収集したRNA画分を、予冷した2倍の高塩分溶液と十分に混合します。次に、キットから真核生物のポリARNAコントロールの希釈ストックを8マイクロリットル加えます。
高塩溶液混合RNAをスイングバケットローターで450,000Gで摂氏4度で5時間遠心分離します。上清を慎重に注ぎ、500マイクロリットルの予冷DEPC処理水でRNAペレットを3回洗浄します。最後の洗浄後、500マイクロリットルのRNA抽出試薬をRNAサンプルに加えます。
混合して10分間インキュベートします。100マイクロリットルのクロロホルムを加え、よく混ぜます。10分間インキュベートして、相分離します。
混合物を12, 000Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。RNAを含む上部の透明な水層を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールと穏やかに混合します。混合物をマイナス20°Cで2時間インキュベートし、RNAを沈殿させます。
沈殿後、再度遠心分離し、上清を捨て、RNAペレットを底に残します。RNAペレットを1ミリリットルの予冷75%エタノールで洗浄します。摂氏4度で10分間12, 000Gで遠心分離し、RNAペレットを風乾します。
乾燥したら、ペレットを30マイクロリットルのDEPC処理水に再懸濁します。260ナノメートルの光学密度に焦点を当てて、220〜750ナノメートルのフルスペクトル分光光度計を使用してRNA濃度を測定します。ポリソームプロファイリングでは、通常の条件下で非ポリソーム画分とポリソーム画分との間に明確な分離が示されました。
摂氏40度の熱ストレスにより、ポリソーム画分の信号強度が大幅に減少しましたが、摂氏22度での2時間の回復後にこの効果が逆転し、信号が制御レベルに戻りました。RNA抽出の結果、熱ストレスによりポリソーム画分のRNAの割合が減少し、22°Cで回収した後に回復したことが示されました。
