資金は、NIH / NIAIDの助成金RO1 - AI - 63457およびARRA助成金補助RO1 - AI - 63457 S1によって提供されていました。我々は、実験グループと共同研究者のすべての現在および過去のメンバーの貢献を認める。

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利害の衝突は宣言されません。

ハンセン病の患者から皮膚サンプルの収集は、皮膚クリニックで働く熟練した臨床医や技術者が必要です。これらのサンプルを扱う研究室の労働者は、白衣、手袋、保護メガネを着用を着用し、人間やアルマジロ組織の感染サンプルを取り扱う際にはバイオセーフティキャビネット内で動作するように細心の注意を払う必要があります。面とツールの消毒も重要です。清潔、滅菌バイオセーフキャビネットでの作業は、DNAサンプルの汚染を回避するために重要です。 DNA抽出は、キアゲンのような企業から抽出キットの開発に比較的容易に感謝となっています。指示に注意深く従っている必要があります。使用しないときは全てのサンプルは低温に保たれるべきである。サンプルの繰り返し、極端な温度変化は避けてください。 本研究で使用したDNAプライマーは、本論文の末尾に参考文献のリストに引用されている様々な企業から注文することができます。ケアは、汚染を避けるために、DNAのない環境でプライマーを用いて動作するように注意が必要です。プライマーは、少量（ 図2a）に分け、乾燥粉末として来るとTEと混合し、100μMの濃度に希釈する必要があります。プライマーのワーキング溶液をさらに10μMの濃度に希釈されています。再び、プライマーが使用され、用意されている地域/フードでDNAサンプルを使用しないでください。 使用しないときは、PCR産物はまた寒さに保つ必要があります。 3％アガロースゲルの調製は、より良いDNAのバンドの分離を与えるが、実行に時間がかかりますでしょう。純粋に定性的な目的のために、2％は通常は十分です。アガロースゲルでDNAを染色するために使用される臭化エチジウム溶液は、皮膚から吸収されている非常にアクティブな遺伝毒性物質である。このソリューションは、それは細心の注意を使用して、常に手袋を着用しているで染色したゲルを取り扱う。任意のDNAサンプルやエチジウムブロマイドの材料を取扱い後はよく手を洗う。エチジウムブロマイド染色液を廃棄する際、制度的なガイドラインに従って洗浄し、ゲル。ゲルは日常的に必須ではありません。FLA方法が確立された後、このステップを排除することができます。それは時間と試薬のかかる作業です。 FLAのための試料の調製に用いホルムアミド溶液はまた、非常に毒性があり、取り扱いには注意してください。その使用後はよく手を洗う。制度的なガイドラインに従って、それを処分する。 ピークスキャナのソフトウェアを使用してFLAの結果を読み込むことは困難な場合があります。アレルコール（タンデムリピートの数）の基本セットは、CSU（ 表4-7）で開発されています。 （M.の他の株がらい研究を行っているとして、それは4月7日テーブルはすべての包括的ではないかもしれないことに留意すべきである。、記載されている範囲outsideのコピー数を持つ対立遺伝子が発見されることがあります。）一つの特定の課題は&quot;スタッター&#39;のピークを伴う。これらは、特に唯一、10（TA）として2〜3塩基対の繰り返しを、含むSTRをのピークの家族、です。時には読み取るための正しいピークを選択することは困難である（ 図7）。この図では、190 bpの陽性対照のピークが主ピークである。 2である高さの低いピークは、4、あるいは6塩基対は、大規模なまたは主ピークよりも小さい&quot;スタッターピーク&quot;と呼ばれているテーリングも混乱を引き起こす可能性があります。テーリングは、以前のテキストで、 図8に記載されています。最後に、PCR産物は、サンプル中の非常に豊富である場合、ピークはダブルスパイクで表示されることがあります。この場合、ピークフォームの中央を読んで。 （ 図6、患者6を参照してください。） データ管理は、この種の作業のための手ごわい作業になる場合があります。タスクまたはプロシージャの日付、演算子、ストリップ/プレートのマップ、FLAの受注、PCR条件とレシピ、ゲルや写真の日付、保存温度、DNAテンプレートの希釈、FLA：などのすべての実験のすべての関連情報を記録することが重要です。電子ファイルの保管場所、等グッド組織とデータの管理は、時間の時間を節約することができます将来、特定の情報の断片を探して過ごした。 ここで説明する実験室での作業は、コロラド州立大学で、世界中の他の場所で数年前から続いている。収集されたデータのすべてを意味し、どのように将来の使用の可能性があるものの拡大写真が現れ始めている。 図10Aおよび図10Bは、これらのDNAフィンガープリントが異なるM.を区別するために使用できる方法を示しています家族（10B）との間であっても国（10A）または間にらい菌。家族やコミュニティリンクされているケースはM.を運ぶことが示されているらい類似または同一のVNTRの歪みの種類の。希望は、それは、伝送ネットワークの早期発見のシステムがそれらの人々のMOSのために開発されるように、ハンセン病の伝送のモード（S）さらなる洞察を得ることが可能かもしれないということです永続的な神経学的および皮膚損傷が行われる前に、リスク、およびその治療薬物療法ではtが開始することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> DNeasy血液と組織のキット</td><td>キアゲン</td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td>マルチプレックスPCRキット</td><td>キアゲン</td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNAプライマー</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5倍または6倍ゲルローディングバッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> B7021S </td><td>あなた自身の*を作るために利用できるレシピ</td></tr><tr><td>臭化エチジウム溶液</td><td>様々な</td><td></td><td> CONから希釈する。 </td></tr><tr><td>こんにちは - ジホルムアミド溶液</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td>ジーンスキャン-500リズ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th>機器</th><th>コメント</th></tr><tr><td> 2冷蔵庫</td><td> 4 ° C：プライマーおよび多重化試薬のためのDNAサンプルの1、1 </td></tr><tr><td> 1電子レンジ</td><td>ゲルを作るためにアガロースと水を加熱するためのまたは適切な方法</td></tr><tr><td> 1オートクレーブ</td><td>材料を殺菌するためのまたは圧力鍋</td></tr><tr><td> PCRマシン</td><td>クラー</td></tr><tr><td>ピペットの2セット</td><td> 0.5から10μlを、10〜100μlを、20〜200μlを、プライマー1000μlの1セット、DNAの1セット</td></tr><tr><td>潜水艦ゲル電気泳動ボックス</td><td>準備ゲル用のフォームや櫛ている。 </td></tr><tr><td>電気泳動用電源</td><td>ゲルボックスへの接続用ケーブルを使用</td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>エッペンドルフチュー​​ブ用</td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフチュー​​ブ/ストリップ用</td></tr><tr><td>キャピラリー電気泳動システム（遺伝アナライザ） </td><td>またはこの分析を実行できる機関へのアクセス</td></tr><tr><td>プラスチック</td><td>使い捨てエアロゾルピペットチップ、エッペンドルフチュー​​ブ、8ウェルストリップ、96ウェルプレート、光学的品質のいくつか</td></tr><tr><td>インターネットに接続されたコンピュータ</td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting of mycobacterium leprae strains using variable number tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

ハンセン病の伝送の研究は、病原以来、 結核菌はらい 、実験室で培養することができない特に困難です。細菌の唯一の源は、ハンセン病の患者、および実験的に感染アルマジロやヌードマウスです。従って、現代の疫学で使用されているメソッドの多くは、ハンセン病の研究のため使用できません。 WHO 1で実装されたハンセン病のための広範なグローバルな薬物治療プログラムにもかかわらず、ハンセン病は約25万の新たな症例は毎年多くの国では風土病のまま2全体M.らい菌ゲノムは、3,4をマッピングされており、多くの遺伝子座は、（マイクロおよびminisatellitesと呼ばれる）2つ以上の塩基対のセグメントを繰り返していることが確認されている。M. 5臨床菌株は、 らいこれらの遺伝子座の多くでタンデム繰り返しセグメント（ショートタンデムリピート、STR）の数が異なる場合があります。5,6,7可変数のタンデムリピート（VNTR）5分析は、ハンセン病菌の異なる菌株を区別するために使用されています。遺伝子座のいくつかは他の人が同じ患者でもある、より急速に変化するように見える一方、繰り返し数であまり変化を示す、他のものより安定しているようです。特定のVNTRsの変動は歪タイピング7,8,9のための適性に関する質問を育てているが、新興のデータは、その安定性で多様化している複数の遺伝子座を、分析し、貴重な疫学的ツールとして使用できることを示唆している。複数の遺伝子座VNTR分析（MLVA）10が中国11,12、マラウイ8、フィリピン10,13、およびブラジル14を含むいくつかの国でハンセン病の進化と伝達を研究するために使用されています。 MLVAは、複数の手順が含まれます。最初に、細菌のDNAは、臨床生検またはスリットの皮膚スメア（SSS）から宿主組織のDNAと一緒に抽出されます。10は 、目的の遺伝子座は、その後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を経由して抽出したDNAから増幅されています。 4月5日別の遺伝子座のための蛍光標識プライマーを10 PCR産物が所望のDNAセグメントの存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動に供されることがあります。18遺伝子座は4つの反応の合計で増幅されていると、反応ごとに使用、とされていますキャピラリー電気泳動を用いた蛍光断片長解析（FLA）のために提出。各遺伝子座の繰り返しコピーの数がわかっているアルマジロ継代細菌からのDNAをポジティブコントロールとして使用されます。 FLAのクロマトグラムは、 ピークスキャナのソフトウェアと断片の長さを用いて検討しているVNTRのコピー数（対立遺伝子）に変換されます。最後に、VNTRのハプロタイプは、パターンが分析され、そして患者の臨床データと組み合わせることで、歪みの種類の分布を追跡するために使用することができます。

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DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

によって引き起こされるハンセン病、<emらい&gt;結核</em&gt;、多くの場所ではまだ流行している。ハンセン病の伝送の普及とモードについて学ぶために、それはどの菌株のかを決定することが重要です。<em&gt; M.らい</em&gt;は、患者を感染している。縦列反復の変数番号（VNTR）タイピングは、そのようなメソッドです。

のDNAフィンガープリント<emらい>結核</em可変数のタンデムリピート（VNTR）を使用>菌株 - 断片長解析（FLA）

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

26.9K ビュー.  Colorado State University. によって引き起こされるハンセン病、結核、多くの場所ではまだ流行している。ハンセン病の伝送の普及とモードについて学ぶために、それはどの菌株のかを決定することが重要です。 M.らいは、患者を感染している。縦列反復の変数番号（VNTR）タイピングは、そのようなメソッドです。

のDNAフィンガープリント結核菌株 - 断片長解析（FLA）