この作品は、DOE五大湖バイオエネルギー研究センター（DE-FC02-07ER64494 DOE科学BERオフィス）からの補助金によってサポートされていました。我々はプロトコルを完成させる上で有用な技術的な議論と貴重なコメントのための博士旭東張と彼のグループのメンバーに感謝しています。

1。サンプルの調製と酸抽出<ol><li>凍結乾燥した土壌サンプルのフィールドコレクションの後に。 </li><li>ボールミル、土壌グラインダー、または乳鉢と乳棒を用いて土壌試料を粉砕して均質化する。 </li><li> 25mLの加水分解フラスコに土壌サンプルを（&gt; 0.3 mgのNを含む）を量る。 </li><li>しっかりと、それぞれの加水分解フラスコに10mLの6M HClをフラスコにN 2ガ ​​スを充填し、キャップ。 </li><li>自動タイマースイッチを使用して8時間105℃インキュベーター内℃で加水分解する。 </li></ol> 2。サンプルの精製<ol><li>インキュベーターからフラスコを取り外し、室温まで冷却する。 </li><li>各フラスコに100μLの内部標準myo-イノシトール（水1mgを加え-1）を追加します。渦巻いて混和する。 </li><li> ST / NS 24 /安定性のためのプラスチック製コップに設定された40関節、200 mLの梨形フラスコに排出するプラスチック製の漏斗を設定します。 </li><li>倍ワットマン＃2定性的円（11センチ径）四半期及び漏斗にセットに。 </LI&gt; <li>スワール各加水分解フラスコを、フィルタする漏斗にスラリーを注ぎます（さらに水〜3 mLで各フラスコをすすぎがあります）。 </li><li> 〜45°C、適用する真空でロータリーエバポレーターを用いて濾液を乾燥させます。 </li><li> 3〜5 mLの水（必要に応じて超音波洗浄機を使用）で各梨フラスコから乾燥した残留物を再懸濁し、40 mLのテフロンチューブに注ぎ、水の第二のアリコートフラスコをすすいでください。 </li><li> 6.8沈殿金属イオンと他の有機分子に1M KOH溶液を使用して - 6.6にpHを調整します。 </li><li> 10分2000 RCFの遠心分離により沈殿物を除去。 </li><li> 40 mLのガラスチューブに上清を注ぐパラフィルムで真空管の開口部をカバーし、-20℃で凍結し、パラフィルムの穴を突く。 </li><li>すべての液体を除去するために凍結上清を凍結乾燥させます。 </li><li> 、3 mLの乾燥したメタノールで残渣を溶解する（必要に応じて超音波浴を使用して）徹底的にボルテックスし、キャップ、チューブ、そして解決するための10分間2000 rcfで遠心塩出。 </li><li> 3 mLの円錐形の反応バイアルに上澄みを移し、45°C（または必要に応じて乾燥した窒素ガスの穏やかな流れの下）で​​RapidVapマシンによって蒸発乾固する。 </li><li>ドライフリーズ100μL回復標準のN-メチルグルカミン（水1mgを加え-1）と1 mLのH 2 Oを追加し、各バイアルに、パラフィルムでバイアルの口をカバーし、-20℃で凍結、パラフィルムを穿孔し、 。 </li><li> 100μLムラミン酸（メタノールでは0.5 mg mL -1）を、100μLグルコサミン（水に1 mgのmL -1）を、100μLミオイノシトール（水1mgを加え-1）を追加、100μLN-：基準を作るメチル（水に1 mgのmL -1）を、1 mLのH 2 O、パラフィルム各バイアルは、-20℃で凍結し、凍結乾燥し、パラフィルムを穿孔。 </li></ol> 3。誘導体化<ol><li>は32 mg mL -1のヒドロキシルアミン塩酸塩および40 mg mL -1の 4 -ジメチルアミノピリジンを含む誘導体化試薬を準備します。ピリジン - メタノール（4:1 v / v）のピペリジンで。 </li><li>しっかりとキャップ、そして徹底的にボルテックス、reactivialsのそれぞれに誘導体化試薬を300μLを追加します。 </li><li> 35分75から80℃の水浴（よく、任意の水がバイアルを入力することができます避けるために、バイアルを密封）でバイアルを置きます。 </li><li>水浴から瓶を取り出し、室温まで冷却する。 </li><li> 3 mLのreactivials、しっかりとキャップ、徹底的に渦のそれぞれに1 mLの無水酢酸を追加し、75から80まで25分°Cの水浴で加熱。 </li><li>水浴から瓶を取り出し、室温まで冷却する。 </li></ol> 4。分離と測定<ol><li>各バイアル、しっかりとキャップ、徹底的にボルテックスに1.5 mLのジクロロメタンを追加します。 </li><li>ソリューションは、独立した二つのフレーズまで邪魔されずに座ってできるようにするために徹底的に各バイアル、しっかりとキャップと渦に1mLの1M HClを追加し、1000μLピペッターを使用して、上部（水性）相を吸引して捨てます。 </li><li>同じfのashionますが、1 mLのH 2 O（最後の洗浄工程と、水性トップフェーズのすべてが削除されていることを確認するために特別な世話をする）と、有機相を3回抽出する。 </li><li> （必要に応じて窒素ガスを使用するか、または乾燥）45 RapidVapを使用して、最終的な解決℃で乾燥させます。 </li><li> 300μL酢酸エチル - ヘキサン（1:1 v / v）でしっかりと少量の挿入とキャップ付き2 mLの琥珀色のスクリューキャップ付きバイアルへの転送に溶解する。 </li><li> 、定常フェーズ5％フェニル - 、95％メチルポリシロキサン（DB-5、または同等品）水素と長さ30 m、内径0.25 mm、0.25 umの膜厚：定量化のために、溶融シリカ極性キャピラリカラムを用いたGC-FIDで分析するまたは0.5 mLの分-1一定流量でキャリアガスとしてヘリウム、。クロマトグラフィーは、プレミアム &quot;不活性&quot;のフェーズと水素キャリアガスで良いですが、より一般的な品種で、ヘリウムと許容されます。検出器の設定は、300°Cであり、400 mLの分-1の空気と30 mLのmin -1の窒素の両方にと水素メークアップガス。注入し、オーブンのパラメータは次のとおりです。250℃に設定GCインレットと1μLスプリット注入（30:1）、初期オーブン温度、120℃、1分間保持、10℃オーブン温度を上げる℃以上。 -1〜250℃、2.5分間保持; 270ランプ°C 20°C min -1の 、2分を保持し、290ランプ°C 20°C min -1の 5分を保持します。キャリアガス流量を調整するので、250°Cにおけるイノシトール、グルコサミンとムラミン酸誘導体溶出、および270におけるN-メチルグルカミン溶出℃に</li></ol> 5。デリバティブ検証<ol><li>分子イオンを識別し、誘導体の分子量を決定するためにソフトなイオン化LC-ESI-TOF-MSを使用しています。 </li><li>デリバティブの対象となるイオンを調べるために感度のGC-EI-MS-SIMまたはGC-EI-MSMS強化を使用しています。 </li><li>誘導体の調製のために複数の同位体標識試薬を使用し、質量シフトを使用MSそれらの同位体標識誘導体の分子イオンとイオンの断片を調べた。 </li></ol> 6。代表的な結果酸分解、サンプル精製、誘導体化とGCの決定（ 図1）：メソッドのプロトコルは、主に4つのステップで構成されています。グルコサミンと標準株から土壌サンプルからムラミン酸の分析の例を図2に示されています。グルコサミンとムラミン酸、マンノサミンとガラクトサミン（グルコサミンの2種の異性体）のほかにも方法を用いて同時に決定することができます。内部標準ミオイノシトールに関する規格の応答の要因に基づいて、我々は土壌試料中のこれらのバイオマーカーを定量化することができます。回復基準は定性的に誘導体化のプロセスを監視するために使用されています。 aldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンおよびムラミン酸の形成のためのスキームを図3に示されている</strong&gt;。 デリバティブの提案された構造は、感度の向上、またはソフトなイオン化LC-ESI-TOF-MS 8用GC-EIMS-SIMにより測定した。電子イオン化により形成されるイオンフラグメントの提案された構造は、イオンのスペクトルを比較することによって検討したサンプルは、さまざまな同位体incorporations 11で調製した。 図4は、非標識剤、D-酢酸無水、およびU -13 C-グルコサミンで調製した3つのシナリオにおける支配的なイオンaldononitrile酢酸のm / z 187の誘導体化グルコサミンの質量変化を示しています。その他の詳細情報および説明は、我々の最近の出版物8、11を参照することができます。この戦略は、デリバティブ化学を勉強するためのモデルとして役立つかもしれません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> 土壌中のグルコサミンとムラミン酸の分析のためのプロトコルの図1測定のフローチャートサンプル。酸分解、精製、誘導体化とGC決定：プロトコルは、主に4つのステップが含まれています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> 図2標準および土壌のイノシトール、グルコサミン、ムラミン酸、マンノサミン、ガラクトサミンとメチルのaldononitrile酢酸のGC-FIDクロマトグラム。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> 図3。aldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンおよびムラミン酸の形成のためのスキーム。番号1は、ニトリルの反応を表しています。番号2は、アセチル化を表しています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> 図4。支配的なイオンstructurに関連付けられているaldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンのマススペクトル（A）非標識剤、（B）D-酢酸無水、（C）U -13 C-グルコサミンで調製したEIモードでのES。星は重い同位体原子または同位体基を表す。

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我々は、開示することは何もありません。

aldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンおよびムラミン酸の分析のための提示GCベースの方法は、土壌から抽出されたこれらのアミノ糖を定量するため、比較的迅速な方法を提供する。誘導体は化学的に安定であり、1回の分析で決定することができます。メソッドは、土壌サンプルに限定されるものではなく、非土壌マトリックスからのサンプルに簡略化することができます。 <p class="jove_con...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ムラミン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M2503-25mgを</td></tr><tr><td> D-（+） - グルコサミン塩酸塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-メチル-D-グルカミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td>ミオイノシトール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td>メタノール（ドライ） </td><td>アクロスの有機物</td><td> AC3269500​​10 </td></tr><tr><td> 4 - ジメチルアミノピリジン</td><td>アクロスの有機物</td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td> VWRインターナショナル</td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine塩酸塩</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> H330-100 </td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P368-500 </td></tr><tr><td>無水酢酸</td> &lt;TD&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A10-100 </td></tr><tr><td>ジクロロメタン（塩化メチレン） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> D37-500 </td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> H303-4 </td></tr><tr><td>塩酸（6M） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S456-4 </td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン塩酸塩-15 N </td><td>アイコンサービス</td><td> IN5280 </td></tr><tr><td>無水酢酸-2 H（D 6 C 4 O 3） </td><td>アクロスの有機物</td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-グルコース-U -13 C </td><td>ケンブリッジアイソトープ実験室</td><td> CLM-1396から1 </td></tr><tr><td>アンモニウムsufate -15 N </td><td>ケンブリッジアイソトープ実験室</td><td> NLM-713から1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> タイプ </td></tr><tr><td>ラピッドバップ</td&gt; <td> LabConco </td><td> 790002 </td></tr><tr><td> Vacumポンプ</td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td>加水分解フラスコ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 06 423A </td></tr><tr><td>マイクロバイアル誘導体化</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td>ヒューレット·パッカード</td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td>ヒューレット·パッカード</td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td>アジレント</td><td> Agilent 1200シリーズHPLCシステムは、Agilent LC / MSD-TOFに結合</td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

微生物を特徴付けるに定量的なアプローチは、生態系内の微生物の状態や機能の広範な理解のために重要である。微生物の分析のための現在の戦略は、従来の研究室文化に依存する技術と直接抽出し、特定のバイオマーカー1、2の決定に基づいて、それらの両方が含まれます。土壌に生息する微生物種の多様性の間でいくつかを培養し、その文化に依存する方法は重要なバイアス、バイオマーカー分析ではない制限を導入することができます。 これらのグルコサミン（最も豊富に存在する）と、ムラミン酸のグルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミンとムラミン酸だけでなく生者と死者の微生物の質量の両方の対策として供されているが、（一意細菌細胞から）3土壌システムで最も重要な成分である、4。しかし、分析に関する知識の欠如は、科学的なピア間の幅広い普及を制限します。すべてのEXIの間で分析方法刺す、GCベースの分析に続いてaldononitrileに誘導体化アセテートは良い最適のバランス精度に関してオプション性、感度、シンプルさ、優れたクロマトグラフ分離、およびサンプル·ストレージ·5時の安定性として浮上している。 ここでは、aldononitrile酢酸への変換後の土壌からのグルコサミンとムラミン酸の信頼性が高く、比較的単純な分析のための詳細なプロトコルを提示します。酸分解、サンプル精製、誘導体化とGC決定：プロトコルは、主に4つのステップで構成されています。ステップバイステップの手順は、前者の刊行物6,7に応じて変更されています。加えて、我々は電子イオン化により形成される構造誘導体の分子イオンを検証するための戦略とそのイオンの断片を提示します。我々はaldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンとMURの分子量を決定するためにGC-EI-MS-SIM、LC-ESI-TOF-MSおよび同位体標識試薬を適用しアミック酸、我々は、各デリバティブ8のイオンフラグメントを調べるためのイオンスペクトルの同位体で標識した誘導体の質量シフトを使用していました。理論的な解明に加えて、分子の誘導体のイオンとそのイオンフラグメントの検証では、生物地球化学的研究9、10に、これらのバイオマーカーのδ13 Cまたはイオンフラグメントを使用して研究者に有用であろう。

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GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

我々は、グルコサミンや土壌から抽出されたムラミン酸のaldonitrile酢酸誘導体のGC-ベースの分析のためのメソッドがプロトコルを記述します。化学的機構の解明のために、我々はまた、デリバティブおよび電子イオン化により形成されるイオンフラグメントの構造を確認するための戦略を提示します。

土壌中の微生物の残留決定のためのAldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンとムラミン酸のGCベースの検出

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K ビュー.  University of Wisconsin, Madison. 我々は、グルコサミンや土壌から抽出されたムラミン酸のaldonitrile酢酸誘導体のGC-ベースの分析のためのメソッドがプロトコルを記述します。化学的機構の解明のために、我々はまた、デリバティブおよび電子イオン化により形成されるイオンフラグメントの構造を確認するための戦略を提示します。

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

環境学

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

A whole cell bioreporter assay with Burkholderia sartisoli RP037-mChe was developed to detect fractions of an organic contaminant (i.e., fluorene) available for bacterial degradation after active transport by mycelia bridging air-filled pores in a water unsaturated model system.

水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, allergy-provoking immune responses. In addition, carbohydrate structures also play a critical role in plant metabolism. Here, we present a simple and rapid method for preparing and analyzing N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus) using an N-glycanase specific for the release of plant-derived carbohydrate structures. To achieve this, crude trichloroacetic acid precipitates of radish homogenates were treated with PNGase H+, and labeled using 2-aminobenzamide as a fluorescent tag. The labeled N-glycan samples were subsequently analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) separation and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for a detailed structural evaluation and to quantify relative abundancies of the radish-derived N-glycan structures. This protocol can also be used for the analysis of N-glycans from various other plant species, and may be useful for further investigation of the function and effects of N-glycans on human health.

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

We describe a simple and rapid method for the preparation and analysis of N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus).

ダイコン品種使用 PNGase H+からN型糖鎖の解析

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

生化学

Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been emerging as promising alternatives to chemical surfactants due to less toxicity, high biodegradability, environmental compatibility and tolerance to extreme environmental conditions. Here, we illustrate the methods used for screening of microbes capable of producing biosurfactants. The biosurfactant producing microbes were identified using drop collapse, oil spreading, and emulsion index assays. Biosurfactant production was validated by determining the reduction in surface tension of the media due to growth of the microbial members. We also describe the methods involved in characterization and identification of biosurfactants. Thin layer chromatography of the extracted biosurfactant followed by differential staining of the plates was performed to determine the nature of the biosurfactant. LCMS, 1H NMR, and FT-IR were used to chemically identify the biosurfactant. We further illustrate the methods to evaluate the application of the combination of produced biosurfactants for enhancing residual oil recovery in a simulated sand pack column.

We illustrate the methods involved in screening and identification of the biosurfactant producing microbes. Methods for chromatographic characterization and chemical identification of the biosurfactants, determining the industrial applicability of the biosurfactant&#160;in enhancing residual oil recovery are also presented.

バイオサーファクタントの組み合わせを使用したオイル回収の強化

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been ...

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal infectivity of pathogenic species. Due to this, there is increasing interest in characterizing bacterial glycosylation and a need for high-throughput analytical tools to identify these events. Although bottom-up proteomics readily enables the generation of rich glycopeptide data, the breadth and diversity of glycans observed in prokaryotic species make the identification of bacterial glycosylation events extremely challenging.
Traditionally, the manual determination of glycan compositions within bacterial proteomic datasets made this a largely bespoke analysis restricted to field-specific experts. Recently, open searching-based approaches have emerged as a powerful alternative for the identification of unknown modifications. By analyzing the frequency of unique modifications observed on peptide sequences, open searching techniques allow the identification of common glycans attached to peptides within complex samples. This article presents a streamlined workflow for the interpretation and analysis of glycoproteomic data, demonstrating how open searching techniques can be used to identify bacterial glycopeptides without prior knowledge of the glycan compositions.
Using this approach, glycopeptides within samples can rapidly be identified to understand glycosylation differences. Using Acinetobacter baumannii as a model, these approaches enable the comparison of glycan compositions between strains and the identification of novel glycoproteins. Taken together, this work demonstrates the versatility of open database-searching techniques for the identification of bacterial glycosylation, making the characterization of these highly diverse glycoproteomes easier than ever before.

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Open searching enables the identification of glycopeptides decorated with previously unknown glycan compositions. Within this article, a streamlined approach for undertaking open searching and subsequent glycan-focused glycopeptide searches are presented for bacterial samples using Acinetobacter baumannii as a model.

アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析のためのシアノバクテリアからの非タンパク質アミノ酸の抽出(英語)

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

化学

ヘッドスペースGC-MSによる動物由来医薬品のトリメチルアミン検出

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the poor compliance of clinical patients. Trimethylamine (TMA) is one of the key fishy odor components in animal-derived medicine. It is difficult to identify TMA accurately using the existing detection method due to the increased pressure in the headspace vial caused by the rapid acid-base reaction after the addition of lye, which causes TMA to escape from the headspace vial, stalling the research progress of the fishy odor of animal-derived medicine. In this study, we proposed a controlled detection method that introduced a paraffin layer as an isolation layer between acid and lye. The rate of TMA production could be effectively controlled by slowly liquefying the paraffin layer through thermostatic furnace heating. This method showed satisfactory linearity, precision experiments, and recoveries with good reproducibility and high sensitivity. It provided technical support for the deodorization of animal-derived medicine.

著者スポットライト:ヘッドスペースガスクロマトグラフィー-タンデム四重極質量分析による動物由来医療におけるトリメチルアミン検出の改良技術  

Here, a headspace gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (HS-GC-MS/MS) method suitable for the determination of trimethylamine (TMA) in animal-derived medicines is described. The protocol includes sample pretreatment, headspace treatment, analysis conditions, methodological validation, and the determination of TMA in animal-derived medicines.

ヘッドスペースガスクロマトグラフィー-タンデム四重極質量分析法による動物由来医薬品におけるトリメチルアミン検出の改良技術

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods substantially contributes to providing extensive knowledge of the metabolism of microorganisms growing in chemically defined media containing unique nitrogen and carbon sources. In contrast, the management through metabolism of multiple nutrient sources, despite their broad presence in natural or industrial environments, remains virtually unexplored. This situation is mainly due to the lack of suitable methodologies, which hinders investigations.
We report an experimental strategy to quantitatively and comprehensively explore how metabolism operates when a nutrient is provided as a mixture of different molecules, i.e., a complex resource. Here, we describe its application for assessing the partitioning of multiple nitrogen sources through the yeast metabolic network. The workflow combines information obtained during stable isotope tracer experiments using selected 13C- or 15N-labeled substrates. It first consists of parallel and reproducible fermentations in the same medium, which includes a mixture of N-containing molecules; however,a selected nitrogen source is labeled each time. A combination of analytical procedures (HPLC, GC-MS) is implemented to assess the labeling patterns of targeted compounds and to quantify the consumption and recovery of substrates in other metabolites. An integrated analysis of the complete dataset provides an overview of the fate of consumed substrates within cells. This approach requires an accurate protocol for the collection of samples&#8211;facilitated by a robot-assisted system for online monitoring of fermentations&#8211;and the achievement of numerous time-consuming analyses. Despite these constraints, it allowed understanding, for the first time, the partitioning of multiple nitrogen sources throughout the yeast metabolic network. We elucidated the redistribution of nitrogen from more abundant sources toward other N-compounds and determined the metabolic origins of volatile molecules and proteinogenic amino acids.

This protocol describes an experimental procedure to quantitatively and comprehensively investigate the metabolism of multiple nutrient sources. This workflow, based on a combination of isotopic tracer experiments and an analytical procedure, allows the fate of consumed nutrients and the metabolic origin of molecules synthetized by microorganisms to be determined.

複数の栄養源の微生物代謝を調査するため同位体トレーサー実験の組み合わせに基づいてワークフロー

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

土壌中の微生物の残留決定のためのAldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンとムラミン酸のGCベースの検出

要約

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