著者らは、優れた技術支援のために寄生虫やクリスティーナ·ホルムの遺伝子型のマイケルAlifrangisとウラAbildtrupに感謝したいと思います。この作品はハワードヒューズ医学研究所（助成55005511）、ルンドベック財団（助成R9-A840）およびニールス·ボーア財団によって資金を供給された。

1。たての選択感染赤血球の生成 PfEMP1タンパク質の表面発現のために新たに選択したカルチャを使用しているときは、このアッセイのために、最良の結果が得られる。この特定の実験3D7 Pにおける熱帯熱マラリア原虫の系統は、前述の1と特異的な抗体を用いて選択した。 1日目<ol><li> Pから満員の血液細胞の収穫を200μl 熱帯熱マラリア原虫の培養は室温で8分間800×gで遠心分離することにより2から5パーセント後期IEを含む。 </li><li> 37 2mlの血液ペレットを再懸℃の暖かい0.75パーセントゼラチン14ミリリットル滅菌チューブ内の溶液、土砂に感染していないとリングステージIEを可能にするために37℃で15〜20分放置します。 </li><li>後期IEを収穫、新しい14 mlチューブに、上相、 すなわち 、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。 </li><li>特異的な抗PfEMP50μlの希釈37℃暖かいRBC-ウォッシュメディアおよび滅菌フィルタ2ml中1抗体。 </li><li> 37℃で30分間、14ミリリットル滅菌チューブとインキュベートし、穏やかに攪拌しながらCの滅菌希釈血清で洗浄後期IEを混ぜる。 </li><li>室温で8分間800 xgでスピンダウンして、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。 </li><li> DynaMaq-15磁石を使用してRBC-ウォッシュメディアとサスペンション倍Dynabeadタンパク質の50μlを洗います。 </li><li> 300μlのRBC-ウォッシュメディアでのDynabeadsを再懸濁し、洗浄された後期のIEに追加します。穏やかに撹拌しながら37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> DynaMaq-15磁石にチューブを転送します。 1〜2分放置し、すべての液体を除去。 </li><li> RBC-ウォッシュメディアの4-5 mlのダイナビーズを再懸濁します。磁石の上に戻ってチューブを転送し、すべての液体を除去する前に、1〜2分間放置します。一度洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 25cm 2の無菌培養fに洗浄したビーズを転送200μlの新鮮な濃厚赤血球を含むラスク。文化にAlbumaxメディアの5-6 mlを加える。 37℃、5％CO 2℃で一晩保存する</li></ol> 2日目<ol start="12"><li>選択されたIEが14ミリリットル滅菌チューブにすべての文化を転送することによって、新鮮な赤血球をreinvadedた培養液からのDynabeadsを削除します。 DynaMaq-15磁石の上にチューブを入れて、1〜2分間放置します。その後、培養フラスコに、すべての液体の背中を注ぐ。 </li><li> 5-10％の寄生虫血症まで、できるだけ少ないサイクルの文化や寄生虫はringstageにあります。 </li><li> IEが正しい表面表現型、どちらPFD1235wのand/orPF11_0008 すなわちタンパク質の発現は1が得られていることを確認するために、FACSによって分析されるべきである。 </li></ol> 2。プローブの調製アンチセンスRNAプローブはPFD1235wとPF11_0008 varのほとんどの可変領域から生成された&lt;Pから/ em&gt;の遺伝子熱帯熱マラリア原虫 3D7ゲノムDNA。 DNAは、製造元の説明（Roche社）によると、それぞれPCRで増幅し、転写のためpSPT18または19ベクターにクローニングした。プローブ（580塩基対（bp）で、長さは590 bp）をそれぞれDIG RNAラベリングキットまたはビオチンRNA標識ミックスを使用して、ジゴキシゲニン（DIG）またはビオチンで標識した。我々は両方のノーザンブロット分析により、単一ラベルのFISH解析1によるプローブの特異性を確認した。 3。 in situハイブリダイゼーションの前に寄生虫の薄層塗抹標本および固定 1日目すべての手順は、RNaseフリーの環境で実行されて、すべての試薬はRNaseフリーまたはジエチルピロカーボネート（DEPC）またはRNase ZAP（Invitrogen）を用いて前処理されています。スライドとカバースリップ残留製造グリースを除去するためにアルコールで洗浄してください。ステップ間で途切れることなく、プロトコルを実行することが重要ですヌクレアーゼの混入の危険性を最小にするために。 <ol><li>標準拡散法3により細い血管映画を作る。顕微鏡の100倍の油浸対物レンズを使用して、IEを数え、文化の中でIEの割合を計算する。寄生虫段がリングとIEサイクルの早期栄養体段階で、おおよその同期であることを確認します。これらは、事前に複製、単核生成段階、発現しているvarの遺伝子のmRNAとこのタイプの単一細胞のFISH転写アッセイに適しています。 </li><li> 1.5ミリリットルRNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブに、5〜10％の寄生虫で、原虫の培養液50μlを転送します。室温で2,000 rpmで1分間遠心します。 </li><li>メディアを取り出し、DEPC処理水に50μlのPBSのpHは7.2を追加します。優しくチューブを攪拌。メディアや細胞の破片から遊離細胞を洗浄するために二回遠心沈降ステップを繰り返します。 </li><li> 4良質薄い塗抹標本を作成します。各スメアについては、上に1スミアを作るよくRNaseフリーフードで合計4ウェルスライド、 すなわち 4スライドガラス、（ 重要なステップ ）のいずれか11ミリメートルの直径。波は乾燥するために空気中に簡単にスライドします。特定のプローブ、RNase処理のために別のスライドと、目的の遺伝子を発現していないIEを含む3枚目のスライドを使用して、他の無関係な遺伝子のための単一のプローブ染色に陰性コントロール-1のスライドの3つの余分なスライドを作成した。 10〜20分間ベンチに乾燥するスライドのままにしておきます。 </li><li>ウェルに4％パラホルムアルデヒド、5％氷酢酸を含む固定液の60μlを添加して薄膜を修正します。室温でベンチで10分間のままにしておきます。 </li><li>室温で穏やかに撹拌して5分間2×SSPEバッファでスライドを洗浄します。簡単に言えばティッシュペーパーで軽く細胞を含むウェルに触れることにより、過剰な液体を除去。 </li><li> 37℃（ 非常に重要なステップで2分間、0.01M HCl中で0.01％のペプシンでスライドをカバー）。室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄します。 </li><li> 10μg/ mlの最終濃度までのRNase溶液を希釈。のRNase溶液60μlをネガティブコントロールスメアをカバーしています。 37℃で30分間インキュベートした後、室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄してください。 </li><li>ハイブリダイゼーション工程に即座に進みます。 </li></ol> 4。固定スライドへのRNAプローブのハイブリダイゼーション 1日目<ol><li>そのようなThermoStar 100 HC4またはRNaseザップを噴霧し、それはティッシュペーパーできれいに拭いて、クリーンオーブンに入れて空のピペットチップボックスとしてハイブリダイゼーションチャンバーを準備します。スライドはハイブリダイゼーション中に乾燥しないことを確認するためにハイブリダイゼーションチャンバーまたはDEPC処理水でボックスの下部のチャンネルを埋める。 48にチャンバーと予熱を閉じ℃に</li><li> 12 ng /μlに、最終濃度のハイブリダイゼーション溶液中にプローブを薄める。加熱ブロック中で5分間65℃プローブ溶液°Cを変性。直ちに氷上で冷却する。 </li><li>簡単に言えば空気は2x SSPEの洗浄された後はスライドを乾燥させてください。慎重にティッシュペーパーで井戸の周り過剰な液体を除去。 </li><li>ハイブリダイゼーションチャンバを開き、チャンバー内でスライドを配置します。 1またはウェルあたり60μlの総体積で両方のプローブを適用します。慎重に滅菌ピンセットを使用してRNaseフリーカバースリップで液滴をカバーしています。 </li><li>チャンバーを閉じて、一晩、少なくとも16時間48℃でスライドをハイブリダイズする。 </li></ol> 5。抗体結合と蛍光増幅 2日目次の手順は、パーキンエルマーから、TSAプラス蛍光パレットシステムに基づいています。すべてのステップは室温で行われています。 <ol><li>穏やかに攪拌しながら5分間スライドをTNT緩衝液で3回洗浄する。 </li><li> 30分間TNBバッファー150μlのウェルをブロック。 </li><li> 1:500の割合で、TNBバッファーで1:100の割合でTNBのバッファ内のHRP-結合のα-DIG抗体とHRP標識α-ビオチン抗体を希釈します。ティッシュペーパーを使用してスライドから余分TNBバッファを削除します。同時に2つの転写物を検出した場合、両方の抗体が一度行くことができます。ウェル当たり抗体-TNB溶液を100μlの合計額を適用し、慎重にカバースリップで覆う。 2時間スライドをインキュベートする。 </li><li>慎重にカバースリップを取り外します。 5分間3回のTNT緩衝液中でスライドを洗浄します。 </li><li> 1:500の割合でチラミド増幅試薬には、FITC蛍光体を希釈し、各ウェルに溶液100μlを適用します。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。 </li><li>慎重に滑ると穏やかに攪拌することにより、TNTのバッファーで5分間スライドを3回洗ってカバーを外します。 </li><li> 1:500の割合でチラミド増幅試薬でCyan3 - フルオロフォアを希釈します。当たり100μlを加えこのソリューションの井戸。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。 </li><li> TNTのバッファ内に浸漬することにより素早くスライドを注意深くリンスしてからカバーガラスを外します。 </li><li> 5分間のTNT緩衝液を用いてスライドを3回洗浄します。 </li><li> DEPC処理水にすばやくスライドを浸す。 </li><li>空気乾燥したスライドを残す。 DAPIを含む抗退色試薬でスライドをマウントします。マニキュアでカバースリップの四隅をシールします。 </li><li>スライドは現在、顕微鏡検査のための準備が整いました。実験は次の日に完成しなければならないならば4でアルミホイルや店舗で覆われたスライド℃で保管してください。スライドの側面の完全な密封は、抗フェード試薬を適用した24時間後に行うことができる。これはプロトコルが完了した後、スライドを1週間用に撮像することができるようになります。 </li></ol> 6。ハイブリダイズしたプローブの可視化<ol><li>顕微鏡の電源をオンにします。標準免疫蛍光顕微鏡はsufficです実験のこの種のientが、あなたはまた、3D映像のためにこれを使用するか、またはあなたの染色された細胞のビデオを得るために共焦点顕微鏡へのアクセスを持っている場合。顕微鏡は、15〜30分間ウォームアップしてください。コンピュータとソフトウェアのスイッチをオンにします。 </li><li>免疫蛍光顕微鏡で染色の品質を確認してください。少数の寄生虫を含むスポットを選択してください。 </li><li>手動で各レーザのゲインを調整します。ピクセルは4-6 M -1 s -1で 、512×512ピクセルへのステップに住む調整します。 </li><li>フレームラムダを使用してテスト撮影してください。レーザーゲインを再調整します。 </li><li>蛍光単一細胞の20良い写真の最小値を取る。 5月20日の寄生虫を含むフィールドの少なくとも2月5日の画像は正寄生虫の割合の公正な概観を得るために必要とされている。 </li></ol>

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	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

のRNA FISH分析は、例えば、ノーザンブロットおよびRT-PCRなどの方法とは対照的に、単一細胞レベルで特定のmRNA転写物の識別を可能にします。これにより、P.、この例では、転写活性および不活性細胞を区別することができ寄生原虫は、ヒト赤血球内原虫。このような全細胞の観察はしばしば必要であり、重要かつ新規な転写パターン1を解明することがあります。 <p cla...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> 338826〜100ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td> Albumaxメディア：RPMI 1640グルタミンソリューション</td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 500ミリリットルのRPMI 1640 5 mlのグルタミンソリューション</td></tr><tr><td> Albumaxメディア：ゲンタマイシン硫酸Albumax溶</td><td>ロンザ</td><td> BE02-012E </td><td> 2.5ミリリットルゲンタマイシン硫酸塩 50ミリリットルAlbumax溶</td></tr><tr><td> Albumax-ソリューション：ヒポキサンチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H9377 </td><td> 0,8グラムヒポキサン​​チン</td></tr><tr><td> Albumax-ソリューション：AlbuMAX II </td><td>私nvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200グラムAlbumax </td></tr><tr><td> Albumax-溶液：RPMI 1640 </td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 4リットルRPMI1640中 maxで磁石で溶かす。 50℃フィルタリング殺菌し、アリコートで-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td>アンバーライト</td><td>シグマ</td><td> A5710-110G </td><td>脱イオンホルムアミドをする樹脂。 </td></tr><tr><td>抗ビオチンヤギpAbのペルオキシダーゼコンジュゲート</td><td>カルビオケム</td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td>抗DIG抗体</td><td> Novusの生物学的製剤</td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> DAPIでアンチフェード試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td>マウントメディアを完全にスライドを密封する24時間前に硬化されています。 </td></tr><tr><td>ビオチンRNAラベリングミックス</td><td&gt;ロシュ</td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td> Nikonデジタル視力DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>メンツェル·グレイザー</td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ25cm 2の Nunclon面</td><td>ヌンク</td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td>フルカ/シグマ</td><td> 32490〜100ミリリットル</td><td>千ミリリットルdeinonized水で1mlのDEPC。攪拌棒を追加し、12時間撹拌した。 30分間オートクレーブ。 </td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td> Nikonデジタル視力DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダイナプロテイン</td><td>インビトロジェン</td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15マグネット</td><td>インビトロジェン</td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミドbioultra 99パーセント</td><td>フルカシグマ/ </td><td> 47671〜1リットル-F </td><td>脱イオン化ホルムアミド：ホルムアミド100ml当たりのイオン交換樹脂が5グラム。 30分かき混ぜる。ワットマン濾紙でろ過。 </td></tr><tr><td> ゼラチン0 75％溶液：ゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G2500 </td><td> 500ミリリットルRPMI 1640中3.75グラムゼラチン。 〜56℃に加熱溶解する。ときに56℃殺菌フィルタリング分注して-20℃で保存。 </td></tr><tr><td> 。ゼラチン0 75％溶液：RPMI 1640 </td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 500ミリリットルRPMI 1640中3.75グラムゼラチン。 〜56℃に加熱溶解する。ときに56℃殺菌フィルタリング分注して-20℃で保存。 </td></tr><tr><td> グルタミン溶液：L-グルタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G3126 </td><td> 500ミリリットル0.9％NaCl中14.6グラムのLグルタミン。溶かし、フィルターのterilizeとアリコートで-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td> グルタミン溶液：塩酸</td><td>シグマ</td><td> H1758 </td><td> 500ミリリットル0.9％NaCl中14.6グラムのLグルタミン。溶解、滅菌フィルタし、アリコートで-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション溶液：ホルムアミドバイオ超99パーセントSSCの20倍</td><td>フルカ/シグマ</td><td> 47671〜1リットル-F </td><td>合計20ミリリットルは、アリコートで-20℃で凍結させておく 10ミリリットル脱イオン化ホルムアミド</td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション溶液：デンハルト50倍濃縮</td><td>シグマ</td><td> D2532 </td><td> 5ミリリットル20xSSC </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション溶液：酵母tRNARocheブロッキング試薬</td><td>シグマ</td><td> R-6750 </td><td> 2ミリリットル50倍デンハルト 酵母tRNAミリリットル当たり250μlの20 mgの</td></tr><tr><td><sチョン·&gt;ハイブリダイゼーション溶液：サケ精子DNA </td><td>フルカ/シグマ</td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4グラムロシュブロッキング試薬 mlのサケ精子DNAあたり10mg（：変性サケspermDNA 96で5分間℃のハイブリダイゼーション溶液に添加する前にクリティカル）の1ミリリットル</td></tr><tr><td>ハイブリダイThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoilインスツルメンツ社</td><td> 1004-0011 </td><td>ハイブリダイゼーションオーブンとDEPC水で水増しRNaseフリーのハイブリダイゼーションチャンバーに置き換えることができます。 </td></tr><tr><td>浸油UV透過蛍光無料</td><td>シグマ</td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td>免疫蛍光または共焦点顕微鏡</td><td>ニコンD-EclipseのTE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td>任意のドラッグストアで利用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBSで20倍：塩化ナトリウム KClを のNa 2 HPO 4×2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC脱イオンH 2 O </td><td></td><td></td><td> pHを7.4にアジャスト 160グラム 4グラム 23グラム 4グラム 1リットル</td></tr><tr><td>パラ4パーセント</td><td>フルカ/ chemika </td><td> 76240 </td><td> 80ミリリットルのPBS / DEPCで4グラムPFA。 65℃の熱PFAが溶けるまで。 20ミリリットルのPBSを加え、溶液が冷却させます。 pHを7.4に調整してください。フィルター。 -20℃でアリコートで保管</td></tr><tr><td>パラ4パーセント/酢酸五パーセント</td><td></td><td></td><td> 950μlのparaformaldhyde +50μlの酢酸</td></tr><tr><td>ペプシン</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン</td><td>カルビオケム</td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-ウォッシュメディア：RPMI 1640グルタミンソリューション</td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 500ミリリットルのRPMI 1640 5mlのグルタミンソリューション</td></tr><tr><td> RBC-ウォッシュメディア：硫酸ゲンタマイシン</td><td>ロンザ</td><td> BE02-012E </td><td> 2.5ミリリットルゲンタマイシン硫酸塩</td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td></td><td> 10 mg / mlの原液を作る。 </td></tr><tr><td> RNaseフリーの1.5 mlチューブ</td><td>アンビオン</td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseのザップ</td><td>アンビオン</td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> 4ウェル11ミリメートルスライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSCの20倍：塩化ナトリウム</td><td>シグマ/アルdrich </td><td> S9625 </td><td> 3 MのNaCl（175グラム/リットル）0.3MのNa 3クエンX、H 2 O（88グラム/リットル）は、1M HClでpHを7.0に調整し</td></tr><tr><td> SSCの20倍：クエン酸ナトリウム水和物</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> W302600 </td><td> 3 MのNaCl（175グラム/リットル）0.3MのNa 3クエンX、H 2 O（88グラム/リットル）は、1M HClでpHを7.0に調整し</td></tr><tr><td> 20X SSPE：NaClを</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> S9625 </td><td> 175.3グラムのNaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20X：のNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> S0751 </td><td> 27.6グラムのNaH 2 PO 4。 </td></tr><tr><td> SSPE 20X：4 EDTA粉</td><td></td><td></td><td> 9.4グラムのEDTA粉 DEPC処理水を加え、pHを7.4に調整。オート20分間オ​​ートクレーブ</td></tr><tr><td> TNBバッファー：TNTバッファー</td><td></td><td></td><td> 10ミリリットルのTNTバッファー</td></tr><tr><td> TNBバッファー：ブロッキング試薬</td><td></td><td></td><td> 0.05グラムブロッキング試薬 ブロッキング試薬を溶解するために、攪拌しながら1時間60℃に溶液を加熱する。 -20℃で保存する。 （パーキンエルマー社TSA-プロトコルから派生したもの。） </td></tr><tr><td> TNTバッファー：トリス/ HCl </td><td>シグマ</td><td> T1503 </td><td> 1Mトリス/ HCl、pH8.0で</td></tr><tr><td> TNT緩衝液：塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S9625 </td><td> 100ミリリットル </td></tr><tr><td> TNT緩衝液：ツイーン20 </td><td>シグマ</td><td> 93773 </td><td> 5 M NaClを30ミリリットル 1ミリリットルのDEPCのdH 2 O869 M1の 室温でpHを7.5に調整してください。 （パーキンエルマー社TSA-プロトコルから派生したもの。） </td></tr><tr><td> TSAはプラスCyanine3 /フルオレセインシステム</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEL753000IKT </td><td>実験を開始する前に、慎重にTSAからプロトコルプラス蛍光パレットシステムをお読みください。 </td></tr><tr><td>滅菌チューブ14ミリリットル</td><td> Almeco - CM LABのAP </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

マラリア感染時のヒト内皮受容体に熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（IE）の接着は 、var遺伝子によってコードされたPfEMP1タンパク質変異体の発現によって媒介される。 ハプロイドP.熱帯熱マラリア原虫のゲノムは1つだけですが、感染症の血液の段階で一度にセルごとに転写されると考えられていたそのうちの約60種類のvarの遺伝子を抱いている。 varの遺伝子転写のような相互に排他的な規制がどのように実現されるか、個々の遺伝子やvarの異なる受容体とPの臨床転帰の差動結合の結果に関連付けられているvarの遺伝子のサブグループの識別があるので、不明である熱帯熱マラリア原虫感染症。最近では、相互に排他的な転写のパラダイムは、個々のPに基づいて転写アッセイによって疑問に呼ばれてきたシングルinfに熱帯熱マラリア原虫の転写産物の同定Pの個々の核内寄生虫によるvarの遺伝子転写のin situハイブリダイゼーション（FISH）分析に蛍光RNAを用いてected赤血球細胞熱帯熱マラリア原虫 、IE 1。 ここでは、Pの単核の var遺伝子転写の解析のためのRNA-FISH法を実施するための詳細なプロトコルを提示熱帯熱マラリア原虫は、ヒト赤血球に感染した。方法はジゴキシゲニンとTSA Plusの蛍光パレットシステム2（パーキンエルマー）、顕微鏡分析と新たに選択されたPを使用してビオチン標識アンチセンスRNAプローブの使用に基づいています熱帯熱マラリア原虫のIE。 in situハイブリダイゼーション法Pのさまざまな段階で発現している遺伝子の多様性の転写および規制を監視するために使用することができます熱帯熱マラリア原虫のライフサイクルとは、他のマラリア原虫種と他の生物や細胞のタイプに適応可能です。

図1に、主な手順やRNA FISH法の持続時間を示すフローチャートである。 シングルPを使用してよく、不十分保存ステンドmRNAのFISH実験の代表的な一連の画像熱帯熱マラリア原虫のIEを図2に示します。この細胞内原虫はDAPIで青色に染色されている小さな（1〜1.5μmの直径）は核を持っています。二十四時間Pの赤血球侵入後<em...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

蛍光灯<em&gt;その場で</em個々の細胞におけるmRNA転写産物を同定する&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）は、複数のメンバーを同時に転写などの多遺伝子活性の分析を可能に<em&gt; VAR</em&gt;多重遺伝子ファミリーで<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em&gt;感染した赤血球<sup&gt; 1</sup&gt;。技術が適応さや遺伝子、細胞及び生物のさまざまな種類で使用することができます。

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

15.3K ビュー.  University of Copenhagen. 蛍光灯その場でハイブリダイゼーション（FISH）は、複数のメンバーを同時に転写などの多遺伝子活性の分析を可能に VAR多重遺伝子ファミリーで熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染した赤血球 1。技術が適応さや遺伝子、細胞及び生物のさまざまな種類で使?...

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

生物学

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...