TMSは、この研究の間にハーラン·トラスト·フェローシップ（GWU）によってサポートされていました。フィールドコレクションと繁殖L.のための資金蛭とE. delphiniiは JTLにNSFの助成DEB 0642438によって提供されました。

1。材料の準備<ol><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブとマイクロピペットプラーを使用して針（1-2μmの先端と3〜4mmのテーパー）を準備します。機器設定：ランプ：561;速度：20;熱：560;ディレイ：1;プル：100;圧力：500。 </li><li>ウシ胎児血清（FBS）の10％および抗凝固バッファの20％（98 mMのNaOHを用い、186のNaCl、1.7mMのEDTAおよび41 mMクエン酸、pH 4.5を補ったグレース培地（GM）の60％捕集溶液を調製）。上記溶液を滅菌条件下で新たに調製し、常に氷上に維持されています。 </li><li> GMの90％FBSを10％ウシ：インキュベーション緩衝液を準備します。このソリューションは、新たに調製し、常に氷上に維持されています。 </li><li>少なくとも15μlの合計×収集·インキュベーション·ソリューションの両方の昆虫の数を準備します。 </li></ol> 2。コレクション·ソリューションとの毛虫の注入<ol><li>最後から二番目のプラグを麻酔血球抽出に先立って20分間氷上でそれらを冷却することによりタールの幼虫。 </li><li> 20ミリリットルのガラス製注射器（ 図2）に接続されているチューブにきれいな毛管針（16ゲージ）の鈍端を取り付けます。収集ソリューションは、ラボ·ベンチで開いて、ゆっくりと緩衝液を用いてキャピラリーを埋める入ったチューブのままにしておきます。毛細血管は、通常毛虫のサイズに応じて、収集ソリューションの約10〜15μlで満たされている（毛虫合計体重の10 mg当たり約1μlの溶液=総体重の0.01％）。解剖顕微鏡の横に配置された粘土のボールの上に針を置きます。 </li><li>ペトリ皿に毛虫を置きます。昆虫は、気門が（ 図3）はっきりと見えるように、その側に配置されるべきである。 </li><li>解剖顕微鏡で見ながら、ピンセットで所定の位置に毛虫を保持し、気門の1つに針の近くに配置する場所で宗派のキューティクルは、一般的に軟質である。優しく昆虫の身体に対してキャピラリーニードルを押してください。針がキューティクルに浸透した後は、キャタピラ（ 図3）に溶液の全体積を注入します。毛虫に気泡を注入避けることが重要である。毛虫の体は注射後（ 例えば 、20％の体積の増加）膨潤するが、破裂したり、にじみ出るべきではありません。 </li><li>傷（ 図3）から漏れるのを防ぐためにバッファ背虫を配置し、氷に毛虫を返します。 </li><li>体液の抽出に使用される各毛虫の手順2.1から2.4を繰り返します。この段階では、すべての昆虫が進む前に、30分間氷上で冷却することができます。 </li></ol> 3。血液細胞の抽出<ol><li>解剖顕微鏡下でシャーレに毛虫を置きます。 </li><li>無菌scalpeを使用して毛虫の臼歯部では浅い（2-3 mm長）を切開する<html> L（ 図3）。腸や他の臓器に損傷を与えないように注意してください。目標は慎重に穿刺にキューティクルであり、個々の昆虫から血球を含有する緩衝液/血リンパミックスを収集します。 </li><li> 10μlのピペットチップで体液ミックス（約10〜20μl）を収集しながら、再び内部の組織（ 図3）を傷つけないように注意しながら、柔軟なプラスチック製のピンセットを使って静かに毛虫を絞る。血リンパは毛虫の体から搾り液滴から収集されます。毛虫の遺体を捨ててください。 </li><li>別のラベルの付いたシリコーン処理、0.5mlのマイクロ遠心チューブに、個々の毛虫から体液を採取します。 </li><li>個々の毛虫から収集された各体液試料にインキュベーション溶液の等量（約10〜20μl）を追加します。すべての回で氷の上に体液サンプルを保管してください。 </li><li>実験に用いた各毛虫の手順3.1から3.5を繰り返します。 </li></ol>血液細胞の定量LE &quot;&gt; 4。 <ol><li>体液試料および血球計数直前に培養液を混ぜる。この治療法は、血球の適切な分離を可能にし、凝集を防ぐことができます。 </li><li>血球計算板の上に、インキュベーション溶液と混合体液サンプル10μlを転送するためにクリーンなピペットチップを使用しています。 </li><li>血球計算板の中央グリッド（ 図3）の化合物の顕微鏡を使用して、大きい正方形（0.1ミリメートル：0.04ミリメートル2、深さが1の正方形の面積）の少なくとも15の血球の数をカウントし、記録します。 15正方形の血球数の総和を得るためにこれらの値を追加します。 </li><li>徹底的に蒸留、脱イオン水で洗浄瓶を用いて血球計算板とカバーのスライドを洗浄し、各サンプル間キムワイプ（キンバリークラーク）で拭いて乾かしてください。 </li><li>各体液サンプルについてステップ4.1から4.4を繰り返します。 </li><li>血リンパvolumのmlあたり血球の平均数を計算次のように各毛虫のe、： </li></ol>血球計算グリッドの各四角形の総容積：（0.04 mm 2の面積）×（0.1ミリメートルの深さ）= 0.004ミリメートル3×15乗= 0.06ミリメートル3全15カウントの正方形=総量。 （全15カウントの正方形/総量カウント15の正方形の血球の総数の合計）×2希釈係数=血球/ mm 3の数×1,000 =血球/体液のミリリットル数。

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	<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).</li><li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+cellular+immune+response.">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).</li><li>Fauvarque, M. O., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+cellular+immunity:+a+story+of+migration+and+adhesion.">Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion.</a> J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).</li><li>Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+roles+of+the+cellular+and+humoral+responses+in+the+Drosophila+host+defense+against+three+gram-positive+bacterial+infections.">Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections.</a> PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).</li><li>Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., R&#228;met, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+phagocytosis+-+still+many+unknowns+under+the+surface.">Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface.</a> APMIS. 119 (10), 651 (2011).</li><li>Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+hemocyte+migration:+an+in+vivo+assay+for+directional+cell+migration.">Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).</li><li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+immunity.">Mosquito immunity.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).</li><li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).</li><li>Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+in+lepidopteran+insects.">Immunity in lepidopteran insects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).</li><li>Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmatocyte-spreading+peptide+(PSP)+plays+a+central+role+in+insect+cellular+immune+defenses+against+bacterial+infection.">Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection.</a> J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).</li><li>Ribeiro, C., Breh&#233;lin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+haemocytes:+what+type+of+cell+is+that.">Insect haemocytes: what type of cell is that.</a> J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).</li><li>Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+larval+and+pupal+hemocytes+of+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta,+determined+by+monoclonal+antibodies+and+density+centrifugation.">Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation.</a> J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).</li><li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm,+Manduca+sexta.">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).</li><li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects,+nematodes+and+Photorhabdus.">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).</li><li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti.">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

医学的に重要な昆虫や鱗翅目昆虫のモデルから血球を抽出するための方法は、以前に9、14が報告されている。血球抽出方法は、昆虫種によると、昆虫とその形態学的特徴の発達段階に適応している。たとえば、 マンドゥカの幼虫体液から分離は容易に腹部15の端の近くに湾曲した角を切り取ることによって行うことができる。ナメクジの幼虫（Limacodidae）この?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス管</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> B100-50から10 </td><td>外径：1.0、ID：0.50ミリメートル</td></tr><tr><td>グレース培地</td><td>シグマ</td><td> G8142 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH3007102 </td><td>不活性化された熱</td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252から40 </td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー血球計数器</td><td> Hausser科学</td><td> 3200 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチックtubiNG </td><td>トライテック</td><td> TT-3-32OD </td><td>外径：3/32&#39;&#39;、番号：1/32 &#39; </td></tr><tr><td>ガラス医療シリンジ</td><td>フォルトゥナ·オプティマ</td><td> D-97877 </td><td> 50mlの体積</td></tr><tr><td>平滑末端針</td><td>小型部品</td><td> NE-162PL-25 </td><td> 16ゲージ×1 &quot;長さ</td></tr></tbody></table>

a simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars

昆虫血球は（哺乳類白血球に相当）昆虫のライフサイクル全体で1いくつかの生理学的過程において重要な役割を果たしている。鱗翅目（蛾や蝶）や双翅目（ハエ真）の受注に属する昆虫の幼虫の段階では、血球はリンパ腺（専門造血器官）や胚細胞から形成され、大人の段階まで行うことができる。胚性血球細胞は、炎症時の開発および走化性調節における細胞遊走に関与している。彼らはまた、細胞のアポトーシスに参加し、胚発生に必須である2。血球は、細胞拡散、細胞凝集、結節の形成、食作用および外国の侵略者3のカプセル化などのいくつかの機能を含む昆虫自然免疫応答の細胞アームを仲介する。彼らは、広報など、また、感染時に特定の昆虫の体液性防御をオーケストレーションするための責任がある抗菌ペプチドおよび他のエフェクター分子4,5のoduction。血球形態と機能は、主にショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエ 6,7、蚊ネッタイシマカやハマダラカ 8,9とスズメガの幼虫、 たばこスズメガ 10、11を含む、遺伝的または生理学的な昆虫モデルで研究されてきた。しかし、少しの情報は、現在野生の12から収集されたもの、特に、非モデル昆虫種の血球の多様性、分類、形態と機能について存在する。 ここでは、野生の毛虫から血球を抽出するためのシンプルで効率的なプロトコルを記述します。我々は最後から二番目の齢Lithacodes蛭 （黄色肩幅のスラグ蛾）（ 図1）とEuclea delphinii（とげのオーク·スラグ）幼虫（鱗翅目：Limacodidae）を使用し、体液の十分なボリューム（昆虫血液）を表示単離され、血球の数値は個々の幼虫からカウントすることができます。この方法は効率的にこれらの種においてだけでなく、フィールドから収穫他の関連する鱗翅目の幼虫における血球の種類を研究するために使用することも、容易に微生物や寄生生物13感染後血球機能を調査するために設計された免疫学的測定法と組み合わせることができます。

本明細書中で説明されたプロトコルは、個々の幼虫から昆虫体液の10〜20μlの最小体積の収集を可能にします。このメソッドを使用して収集血球は細胞凝集、メラニンの欠陥、組織片などの汚れから保護されています。したがって血球は容易に顕微鏡下で観察し、計数することができ、いくつかの昆虫が少ないホスール内で観察することができます。私たちは、サンプル中の血球の大部分はpla...

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A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

昆虫血球は、昆虫開発のすべての段階を通して免疫および非免疫の両方の多くの重要な機能を、実施しています。血球の種類と機能の私達の現在の知識では、昆虫の遺伝的モデルに関する研究から得られている。ここでは、野生の毛虫から血球を定量化し、可視化、抽出するための方法を提示する。

ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

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Research

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Biology

16.1K ビュー.  The George Washington University. 昆虫血球は、昆虫開発のすべての段階を通して免疫および非免疫の両方の多くの重要な機能を、実施しています。血球の種類と機能の私達の現在の知識では、昆虫の遺伝的モデルに関する研究から得られている。ここでは、野生の毛虫から血球を定量化し、可視化、抽出するための方法を提示する。