著者らは、cDNAのアプリのための博士ホイ鄭（ベイラー医科大学）に感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成R21AG031948（DB、JMB）、F30AG030878（ESS）R01DK073394（AFO）、生物医学研究のためのジョン·シーリー·メモリアル基金基金（AFO）、ジャン℃、ウィリアム·D·ウィリス脳神経情報研究基金によって資金を供給された（ESS）を表示します。 JMBはトランスレーショナル研究奨学生プログラムにおける学者とテキサスメディカルブランチクロード·E·ペッパー古いアメリカ人はインディペンデンスセンターの大学のメンバー（NIHのグラントそれぞれUL1RR029876およびP30-AG-024832、でサポートされている）です。

<html> 1。組換えAPP細胞内ドメイン（AICD）の発現<ol><li>変換E.大腸菌ベクターpGEX-4T-1（GE Healthcare社）にクローニングされたヒトAICD（残APPの649から695まで、神経アイソナンバリング）とBL21を痛める。このベクターは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質のC末端部分としてAICD発現するであろう。このベクターは、GST部分の除去を容易にするために、トロンビン切断配列をコードしている。をpGEX-4T-1にAICDクローニングの詳細は、私たちの前の刊行物4に記載されています。 </li><li>単一コロニーから、アンピシリン（100μg/ ml）を含むLB液体培地10mlを接種し、激しく振とうしながら37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌朝、一晩培養した培養液5mlで1リットルフラスコに400mlのLB /アンピシリンに接種。 </li><li>精力的な600nmでの光学密度まで振っ0.6から0.4に到達していると37℃でインキュベートする。これは、通常2〜2.5時間かかります。 </li></ol>コンテンツ&quot;&gt;この時点で、それが（ 図1A、B参照）、SDS-PAGEにより精製をフォローするための小さなサンプル（〜10μl）を取ることが望ましいかもしれない。後続の各精製工程は、分析のために除去小アリコートを持つべきSDS-PAGEによる。 <ol start="5"><li>イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を0.4mMのを追加することによって、GST-AICDの発現を誘導する。活発で5時間振とうしながら37℃でインキュベートする。 </li><li> 4℃で15分間6000 xgで細胞を遠心℃に細胞ペレットは、手順のこの時点では、数ヶ月のために-80℃で保存することができます。 </li></ol> 2。 GST-AICDの精製<ol><li>次のように50mlの溶解緩衝液を準備します1mMジチオスレイトール、1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.1％トリトン-X100、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ·ダイアグノスティックス）と、リン酸緩衝生理食塩水。氷上で冷却する。 </li><li>上の雪解け細菌ペレット（以前凍結した場合）氷。 </li></ol>この時点では、すべてのステップが℃で分解を制限するために4時に実行されていることが重要です。すべてのチューブ、バッファ、および他の試薬はあらかじめ冷却する必要があります。フレンチプレスまたは溶解のための乳化剤を使用している場合は、これらも同様に予め冷却する必要があります。 <ol start="3"><li>徹底的に溶解緩衝液20mlに、細菌ペレットを再懸濁します。氷上の10mlのピペットを用いてボルテックスと摩の組み合わせは、ペレットを完全に再懸濁を保証します。 </li><li> 4℃30,000 psiまで予冷乳化剤を通じて再懸濁した細菌細胞（ 例えば 、Avestin EmulsiFlex-C3）やフランス語圧力セルを渡します。乳化剤二度目を通してライセートを渡します。あらかじめ冷却し、50 mlチューブにライセートを収集します。 </li></ol>これら2つの楽器の主な利点は、試料の加熱を最小限に抑えることです。超音波処理の一般的に使用される技術は、超音波プローブの先端にかなりの熱を発生し、組換えタンパク質の凝集が発生することがあります。 <ol start="5"><li> 30分間、15,000×gでライセートを遠心分離します。予冷50 mlチューブに上清を分離しておく。 </li><li>グルタチオン - アガロース（Sigma-Aldrich社製）の50％スラリーの500μlを添加する。 4℃で30分間回転させます50mMトリスpH7.8、0.1％トリトン-X100、0.5mMのジチオスレイトール、10mMの還元型グルタチオン：サンプルは回転している間、新鮮な溶出緩衝液を作る。 </li></ol>室温で実施されているプロトコルの唯一のステップは、溶出ステップである。したがって、溶出緩衝液は室温に保たれている。溶出緩衝液は、新鮮な準備されるべきである。 <ol start="7"><li>緩衝生理食塩水（90から130μm）の粗いフィルター（エバーグリーン·サイエンティフィック）と使い捨て5 &quot;ポリスチレンクロマトグラフィーカラムにライセートとスラリーを注ぐ。カラムを洗浄5回はリン酸3mlで。 </li><li>カラムの底部にフタをし、室温の溶出バッファー500μlを添加する。の上部のキャップを閉めカラム、室温で5分間回転させます。冷やした1.5​​ mlのマイクロチューブに溶出液を集める。溶出をさらに2回（1.5ミリリットル総溶出液）を繰り返します。 </li><li>リン酸塩の4リットルで10,000分子量カットオフ透析膜（ 例えば 、サーモサイエンティフィックスライドインアナライザの透析カセット）に溶出液を透析は4℃で一晩緩衝生理食塩水リン酸塩の付加的な4リットルに対して透析は4℃緩衝食塩水℃で1時間、次の日のために。 </li><li>透析カセットからタンパク質を除去し、GST-AICDの収率を決定するためにタンパク質定量アッセイを行う。文化の400ミリリットルからの典型的な精製は、10〜20 mg / mlの濃度でタンパク質の精製&gt; 20 mgの利回りになります。 -80℃で200μlのアリコートと凍結にアリコートタンパク質を℃に</li></ol> 3。 GST-AICDとAICDの精製のトロンビン切断<ol><li>雪解け200精製したGST-AICDのμlと1 U /μlのthromb20μlを追加37インチで一晩インキュベート℃、 </li></ol>トロンビンの品質と純度は、メーカー間でかなり異なり、汚染の重要な原因となることができます。私たちは、GEヘルスケア（試薬の表を参照）からトロンビンを使用しています。一晩インキュベートした後、融合タンパク質の&gt; 95％が（ 図1B）を切断する必要があります。 <ol start="2"><li>トロンビンとの一晩の開裂した後、解放されたAICDの一部が凝集を受け、溶液が濁って見える可能性が高い。 4℃で30分、20,000 xgで遠心分離することによって集約された材料をクリア予め冷却マイクロチューブに上清を取り除きます。 </li><li>それぞれ、GSTとトロンビンを除去するために50パーセントグルタチオン - アガローススラリーおよび50μlの50パーセントのp-アミノベンズアミジン - アガローススラリーの50μlを添加する。室温で5分間回転とともにインキュベートする。 </li><li>堆積物に簡単にアガロースビーズを遠心し、新しいチューブに上清を除去する。トンを抽出グルタチオン - アガロースを持つ彼は、GST 4回以上。のp-アミノベンズアミジン - アガロースを持つ単一の抽出はトロンビン20Uのを除去するのに十分である。 </li><li>精製AICD5μlの上のタンパク質定量アッセイを行う。 400ミリリットルの培養物からの典型的な収率は0.2から0.5 mg / mlの濃度で50から100μgのです。高い利回りは、GST-AICDの大きなボリュームを切断することにより可能です。 </li></ol>精製AICDは生化学/生物物理学的特性評価のために新たに調製しなければならない。未使用の材料は捨てられるべきです。これは、サンプルを凍結乾燥し、バッファ6の小さいボリュームに再懸濁することによりAICDを集中させることも可能です。検出した場合AICDブロッティング（フィルタトラップまたはドットブロットアッセイした後など）、PimplikarとSuryanarayana 12で説明したように、膜上の抗原検索を実行する必要がある必要があります。 4。原子間力顕微鏡（AFM）用AICD集約<ol><li>希釈は新鮮pでAICDに調製hosphateは、15μlの最終体積で0.1 mg / mlの濃度に緩衝生理食塩水。この時点で、種々の化合物および/またはタンパク質は、それらがAICDの凝集を阻害するかどうかを判断するために添加してもよい。例えば、私たちはubiquilin-1のモル濃度は、このアッセイ4 AICDの凝集を防ぐことが示されている。 </li></ol>また、このようなフィルタトラップアッセイおよび光散乱4などの生化学的実験の集計大きな反応ボリュームへの可能性があります。我々は、成功は1μMという低濃度に希釈AICDと400μlの同じ大きさの反応混合物にフィルタトラップアッセイを実施いたしました。 <ol start="2"><li> 48時間エッペンドルフサーモミキサーで800 rpmで振とうしながら43℃でサンプルをインキュベートすることにより、熱凝集を誘導する。この温度は4,13モデルシャペロン基板クエン酸合成酵素の熱凝集を調べるシャペロンアッセイに基づいて選ば ​​れました。 </li></ol><ol start="3"><li>脱イオン水で20倍にサンプルを希釈し、新たに切断されたマイカ上に2μlをスポット。一晩デシケータに試料を乾燥させてください。それは経験的にイメージングのための最適な希釈を決定する必要があるでしょう、そして、その結果、10に至るまでいくつかの希釈 - 100倍は賢明であろう。 </li><li>モード14タッピングAFMの動作を使用して、集約AICDを視覚化します。使用カンチレバーは2nmの名目先端半径を持つ金コーティングマイクロシャープ窒化レバー（MSNL、ブルカー）です。典型的なタッピング振幅DURるイメージングは​​、カンチレバーの共振周波数（30〜50 kHz）を10〜20 nmである。 </li></ol>我々は、さまざまなタンパク質凝集体の画質とコントラストが印加された力と実験の期間に依存していることがわかった。先端によってサンプル摂動を最小限に抑えるために、我々は95％以上のセットポイント比を保ったまま、5〜10分に各サンプルのスキャンを制限することにより、比較的低い印加された力を維持していた。画像処理はWSxMソフトウェア（ナノテック）で行った。標準的な画像処理は平面減算と平坦で構成されていた。私たちの研究所では、 &quot;自作&quot;商業の走査型プローブ顕微鏡制御システム（ナノテック）に接続AFMの15を使用しています 。 5。代表的な結果発現およびGST-AICDの相対的な富を図1Aに示されています。溶解後、融合タンパク質の大部分は可溶性画分に存在しているので、inclusiから抽出遺体には必要ありません。グルタチオンアガロースカラムから溶出した物質は、&gt; 95％純粋である。 図1に示すように製造においては、カラムから溶出されたタンパク質の濃度は14.5 mg / mlであり、収率は22ミリグラム（400ミリリットルの開始培養物からの）であった。トロンビン20 Uで一晩、この準備の200μlの切断は、融合タンパク質（ 図1B）のほぼ100％切断をもたらした。 （ &quot;開裂&quot;レーン、 図1Bを参照）クーマシーブルー染色によって検出可能ではないこととして使用されるトロンビンの量が十分に低い。トロンビンとGSTの除去は材料の一部が失われる結果、しかしそれは、0.35 mg / mlの濃度でAICDの70μgのこの準備で収率で&gt; 90％の純度であった。 図1Cは AICDの集約のためのフローチャートを示しているとその後の分析。 AFMによって撮像AICD集計は一般的に回転楕円体/非晶質であり、サイズの範囲は50〜100nm（ 図1D、F）から。集約された材料はシャペロンubiquilin-1の等モル量の凝集反応（ 図1E）4に追加されたときに検出されない。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> 図1。 AICDの精製および集約。精製プロセスの各ステップで収集されたサンプルの）クマシーブルー染色。非誘導および誘導されたサンプルについては、総菌20μlをゲル上で泳動した。上清画分については、溶解液（20ミリリットルの総量から）の5μlをゲル上で泳動した。ペレット画分については、ペレットを溶解緩衝液20mlに再懸濁し、この材料5μlの°Cの前にゲルにロードする4℃で30分間水浴ソニケーターで超音波処理した。フロースルーは、5μlをゲル上で泳動した。ゲルにロードし、溶出液の量が示されている。 B）が切断されていないと切断されたGST-AICD（2μl）を、1と5＆mのクマシーブルー染色したゲルは、U;リットル精製AICD。 AICD浄化、集計、分析のC）フローチャート。熱的に集約不在（D）と分子シャペロンubiquilin-1の存在下（E）にAICDのA、D、E）代表AFM像。 F）はAICD凝集体の粒度分布のヒストグラム。

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W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルでは、構造生物物理、生化学的解析のための高純度AICDを取得するための手順を説明してきました。この手順では、洗練されたクロマトグラフ装置を必要とするため、ほとんどの研究室にアクセス可能であることはありません。他のグループは、構造的/生化学分析のために、GST-AICD 17から19を含め、AICD 5-7,16を精製しました。以前のプロトコルの欠点は貧しいAICD...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>をpGEX-4T-1 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td>トロンビン</td><td> GEヘルスケア</td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォードタンパク質アッセイ試薬</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td>クマシーブルー</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG（イソプロピル-β-Dチオガラクトピラノシド） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td>グルタチオン - アガロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G4510 </td><td></td></tr><tR&gt; <td>のp-アミノベンズアミジン - アガロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td>完全プロテアーゼインヒビターカクテル</td><td>ロッシュ</td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td>スライド-A-アナライザの透析カセット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィーカラム</td><td>エバーグリーン·サイエンティフィック</td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td>乳化剤</td><td> Avestin株式会社</td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td>非常にお勧め</td></tr><tr><td>エッペンドルフサーモ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td>雲母ディスク</td><td>テッドペラ</td><td> 50から12 </td><td></td></tr><tr><td> AFMのカンチレバー</td><td>ブルカー</td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxMソフトウェア</td><td>ナノテック</td><td> N / A </td><td>金曜日eeのダウンロード</td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

アミロイド前駆体タンパク質（APP）はアルツハイマー病（AD）の発症に関連するI型膜貫通タンパク質である。 APPはAPPの細胞内ドメイン（AICD）と呼ばれる大きな細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインによって特徴づけられる。分泌経路を介して成熟中に、APPは、α、β、γ-セクレターゼ1と呼ばれるプロテアーゼによって切断することができる。 β、γ-セクレターゼによるAPPのシーケンシャルタンパク質分解切断は小さなタンパク質分解ペプチドと呼ばれるAβ、アミロイド形成であり、老人斑のコア成分の生産につながる。 AICDはセクレターゼ処理後も膜から遊離され、Fe65とTIP60との相互作用を介して、複数の標的遺伝子2,3の転写調節に関与する核に移行することができます。 AICDを含む、タンパク質 - タンパク質相互作用は、人身売買、加工、ホロAPPおよびそのC-TERMINの細胞機能に影響を及ぼす可能性がアルの断片。我々は最近、AICDがAD-関与する分子シャペロンubiquilin-1 4により阻害され、in vitroで集計され、このプロセスができることを示している。 Fe65 7にバインドされたときに、これらの知見と一致して、AICDは、疎水性ドメインを露出しており、本質的にin vitroで 5,6 で乱れる、しかしそれは安定な二次構造を取得します。我々はubiquilin-1は、in vitroおよび4無傷細胞における凝集防止、AICDの不適切な分子間及び分子内相互作用を防止することを提案した。ほとんどの研究は、ADの病因におけるAPPの役割に焦点を当てる一方で、このプロセスにおけるAICDの役割は明らかではありません。 AICDの発現はアポトーシス8,9シグナル伝達経路を調節するため、10のシグナリングカルシウムを調節することを誘導することが示されている。 AICDの過剰発現およびトランスジェニックマウスモデルにおけるFe65アルツハイマー病理11等を誘発し、最近AICDがブラジャーで検出されている適切な抗原検索技術12を使用するときにウェスタンブロッティングによりライセートインチAICDの、構造的、生化学的、および生物物理学的研究を促進するために、我々は非常に純粋なAICDタンパク質の組換えを大量に生成するための手順を開発しました。我々は、さらに原子間力顕微鏡によるAICDと分析の in vitro熱凝集に誘導する方法を説明します。記載されている方法は、生化学生物物理学、構造AICDの特性評価およびAICD凝集分子シャペロンの効果のために有用である。

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

APPの細胞内ドメイン（AICD）の大規模な精製のための方法が記載されている。我々はまた、誘導する方法を説明します<em&gt; in vitroで</em原子間力顕微鏡による&gt; AICD集約と可視化。記載されている方法は、構造的/生化学AICDの特性とその凝集分子シャペロンの効果のために有用である。

アミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインの精製と集約

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

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JoVE Journal

Medicine

11.7K ビュー.  University of Texas Medical Branch. APPの細胞内ドメイン（AICD）の大規模な精製のための方法が記載されている。我々はまた、誘導する方法を説明します in vitroで AICD集約と可視化。記載されている方法は、構造的/生化学AICDの特性とその凝集分子シャペロンの効果のために有用である。

ビデオ: Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

アミロイドのための前方脂肪パッドのFNAの実行と処理

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

医学

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

MACSの精製された感光体前駆体細胞の成人マウス・レチナへの副腎移植

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&amp;#946; and Tau Neuropathology

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

アミロイド-βおよびタウのトランスジェニックマウスモデルにおける自発的交互作用の評価、新規対象の認識および肢の把握Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

コラーゲン誘発凝集に対するPannexin1阻害剤の効果ブリリアントブルーFCF：比濁法は、人間に洗浄血小板を

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

マウス心ペリサイトの単離と精製

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

ヒトADSCからの細胞外小胞の超遠心分離法による単離

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

著者スポットライト:ヒトADSCからの細胞外小胞の抽出と精製の標準化と改善

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の精製とキャラクタリゼーション

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...