国防総省（米国防総省の国防高等研究計画庁、若い教員賞、グラント番号N66001-09-1-2117）とNINDS（R15NS070734）の資金による研究。

1。動物の手術の準備 1。実験対象大脳皮質ニューロンにおける青色光感受性陽イオンチャネル、チャネルロドプシン2を発現しているJAX株＃7612）または他のマウス; B6.Cg-TG（Thy1-COP4/eYFP）18Gfng / Jト ​​ランスジェニック線9のマウスを使用しています。 B6.Cg-TG（Thy1-COP4/eYFP）18Gfng / Jト ​​ランスジェニックラインの大脳皮質に水色のアプリケーションは9,10電位を脱分極し、アクションを起こすためにチャネルロドプシン2を発現する錐体細胞を引き起こす。錐体細胞の活性化の結果として、局所介在ニューロンが活性化され、潜在的な変化は、刺激10敷地外のニューロンに伝達されます。適用される規制ガイドラインの遵守における無菌条件下で手術を行います。オートクレーブ手術器具とsoftpacks（手術野、ガーゼパッド）;ホットビードはすべて熱トレラント移植金属デバイス（カニューレ、ネジ、ワイヤー）を殺菌する30秒のために、エタノールで10秒浸漬して、熱不寛容植込み型デバイス（光ファイバケーブル、プラスチックコネクタ）を駆除、打撃エタノールに浸した項目は、缶詰の空気によって乾燥した。 2。スカルの麻酔、定位配置とクリアランスマウスを麻酔しIMPAC 6統合マルチ患者（VETイクイップ社）システムを使用してください。誘導および手術中のメンテナンスのために3パーセントIsoflurane/97％酸素の場合は5％Isoflurane/95％酸素を使用しています。それは毛布をこの温度に保たれている場合、本体の温度を監視する必要はありません37℃に設定した循環水の毛布の上に動物を置きます。 3。移植のためのスカルの準備頭蓋骨の上からすべての毛皮を削って切開部位を準備します。剃毛面積が耳から目から頭蓋骨の後端に耳と前後に横方向に拡張する必要があります。 3连続露出した皮膚の消毒ベタジンのe綿棒は、エタノールが続く。目と目の間から頭蓋骨の後ろに、頭蓋骨の上に内側切開を行います。過酸化水素と滅菌生理食塩水（0.9％NaCl）で頭蓋骨をきれいにしてください。焼灼ツールで出血をコントロール。定位座標を決定するためブレグマとラムダの位置を確認し、マークします。我々が使用している電極/ optogenetic刺激構成に対する定位座標は、 表1に示すと図1（a）に模式的に示されている。 4。頭蓋骨に着床部位の調製頭蓋骨内の各移植部位を確立するために0.5ミリメートルボールバリビットで高速歯科用ドリルを使用します。スクリューの挿入を容易にするために、0.7mmのボールバリビットを使用して、各ホールの外部余白を面取り。 5。カニューレ、EMGのリードおよびEEGリードの挿入と確保脳波のねじ（長さが0.8ミリメートル、コーティングされていない3の2cmと挿入0ゲージの錫メッキ銅バスが穴に）頭をねじ込み、手でスロットにそれらを駆動するプリはんだ付けワイヤーは所望の深さを得るために約4-5回転を回し。アクリルセメントで頭蓋骨とアンカーに貼り付け後、定位カニューレホルダーのある場所で、ガイドカニューレを保持します。各ガイドカニューレは、開存性を維持するために、実験の時間（10〜14日）に手術の時からダミーカニューレ/スタイレットを（プラスチックの一つ、一部＃C312 DC \ 1）を含める必要があります。 6。手術部位を閉じる一度脳波、ガイドカニューレは、頭蓋骨にある歯科アクリルセメント（ - オーソ·ジェットセメントラング歯科）と一緒になって結合して配置されている。セメントセットした後、乾燥したセメントマウンド上記プラスチックコネクタ（ピナクルテクノロジーの一部＃8402）を配置します。半田脳波リードからプラスチックコネクタの接点が発せられるワイヤの端。ワイヤー包むセメントにつながる。その後、項部筋肉をEMGの線を描くsは21ga針のバレルにそれらをスライドさせて筋肉を貫いた。彼らは筋肉を終了する場所のすぐ遠位これらのワイヤの周りに5から0ナイロン縫合糸の二重外科医の結び目を作る。逆カットP-3針と5から0ナイロン縫合糸を使用して、一緒に戻ってシングル割り込ま外科医の結び目と筋肉組織にアクセスするために撤回された皮膚を縫合。 7。術後鎮痛およびリカバリ 手術直後、抗炎症として（0.1 mg / kgの皮下）（0.1 mg / kgの皮下）鎮痛剤とフルニキシンメグルミンとしてブプレノルフィンを投与すると、毎日1から2日後に手術。動物は実験前に少なくとも7日間は標準のコロニーの住宅事情で回復することができます。標準コロニー住宅以外の追加の注意を払って、カニューレが所定の位置に固定留置スタイレットと、少なくとも2週間の特許を維持することが期待できる。脳波と筋電図センサも保持することが期待できるこの期間中に機能を提供します。 2。時限光パルスの生成 1。 MCの刺激ユニットのプログラミングデスクトップコンピュータとのUSB接続を経由して、MC-刺激ユニット（マルチチャネル·システム）を接続します。 MCの刺激ユニットをプログラムするためのスプレッドシートのようなMC-刺激ユーザー·インターフェースを使用しています。上の期間のための望ましいTTL（トランジスタ·トランジスタ·ロジック）は、電圧、ピリオドオンとオフの刺激の持続時間は、目的の秒あたりのサイクル数と、全体の刺激セッションのための繰り返しサイクルの総数を入力します。詳細については、MC-刺激テクニカルマニュアルを参照してください： 3。光ファイバPrの製造/組立大脳皮質に光送達のためのOBE <ol><li>必要な物資や機器は、次のURLで参照されています： <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li><li>切断および光ファイバケーブルの研磨。 <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdfは</a> </li></ol> 4。げっ歯類のOptogenetic刺激システムの組み立て 1。 MC-刺激ユニットとレーザーのインターフェース MC-刺激ユニットがプログラムされると、ON / OFF信号を5ボルトバイナリのスタンドアロン信号発生器としてそれを実行します。 BNCコネクタを備えたレーザーのTTL対応のパワーユニットに、MC-刺激ユニットを接続します。 2。光ファイバケーブルを介してレーザ出力を生成マニュアルをデジタルディスプレイやレーザパワー·ユニットの変数出力ダイヤルを使ってLYは、レーザーの出力を調整します。リボンケーブルを介してレーザーにレーザー電源ユニットを接続します。女性のFC（フェルールコネクタ）光ファイバパッチケーブル（200μmの直径のガラス伝導繊維はアクリルポリマークラッド光反射に包まれた長さ3 m）のオスFCコネクタにレーザーの光ファイバアダプタを接続します。 3。ロータリーコミュテータ：動物にレーザーを伝える 2コリメートレンズ（ドーリア式レンズ）を包む光ファイバーロータリージョイントの両端に発信される光ファイバケーブル（長さ3m）と配信の光ファイバケーブルを（長さ45 cm）の接続します。光ファイバーロータリージョイントは、整流子としての役割を果たします。そのケージ約動物が移動すると、ロータリージョイントは、光ファイバケーブルの断線を防ぐため、回転させる。金属に貼付整流子にプラスチック·ケーブル·タイを使用して動物が収容された円筒状のケージの上に置か立つ。 4。配達光ファイバの取り付けヘッドへのケーブルカップ状の手のひらの下にマウスをピン片手でマウスを抑制。オリエント実験の中間と人差し指で頭。光ファイバーカニューレのために配置ガイドカニューレからダミーカニューレを外します。無菌25ga針を用いてデブリのガイドカニューレをクリアします。手で光ファイバーケーブルを挿入して、ダミーカニューレから引き揚げスレッドスクリューキャップ付き光ファイバガイドカニューレに固定します。フラット切断端から一定の距離に、光ファイバケーブルで結ば縫合糸の結び目によって、脳内の光ファイバケーブルの挿入の深さを制御します。全体の実験装置は、 図1Bに示されています。 5。 Optogenetic刺激時の脳波に定義されたスリープと乳酸濃度の測定 1。乳酸センサのPrecalibration 乳酸センサの航海は 、 インビトロで行われるキット（ピナクルテクノロジー一部＃7000-K1-T）。センサーは、製造元のプロトコルごとに段階的にL-乳酸塩の3つの濃度にさらされて、液（pH7.4）リン酸緩衝生理食塩水で平衡化されています。 2。乳酸センサおよびEEGケーブルの挿入光ファイバケーブルの挿入手順（セクション4.4）と同じ方法で、頭蓋骨に取り付けられた乳酸ガイドカニューレに事前に較正されたセンサを挿入します。バイポーラプラグコネ​​クタ付きピナクル8400バイオセンサのプリアンプに乳酸センサを接続します。外科的に埋め込まれたheadmountの8ピンコネクタにこのプリアンプを取り付けます。 3。 Optogenetic刺激強度を確立データを収集する前に、optogenetic刺激の強度を調整するため、レーザ強度​​コントロールノブを使用しています。脳波応答の振幅は、体系的に研究されていない要因のために、動物の向こう側に異なるでしょう<html> dは、刺激の開始時に目視により確認しなければなりません。実際には、80から120μWattsの強度は一般的に刺激の周波数で約50％の脳波の振幅の増加を生成します。事後高速フーリエ変換解析（5.5節を参照してください）​​応答の絶対的な大きさを定量化することが必要である。 4。データ収集ピナクル8400システムを使用してデータを収集します。 <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html</a> 。 5。 Neuroscoreとデータ処理 ：Neuroscoreインタフェース（DataSciences、インターナショナルと脳波と筋電図データの目視検査によってスリープ状態を分類<a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a>または海牛インタフェース（ピナクル技術）：F = &quot;http://www.pinnaclet.com/sirenia.html&quot;ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt; http://www.pinnaclet.com/sirenia.html）。覚醒、ノンレム睡眠、または脳波と筋電図に基づいて、レム睡眠のように10秒エポックのプロセスデータ。追加の分析と統計的検定のためにMicrosoft Excelスプレッドシートなどのデータを保存します。

<ol>
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特別な利害関係は宣言されません。

方法は、1つは、以前は不可能タイムスケールで解糖中間体の乳酸の脳内濃度の睡眠と変化との関係を測定することができますここで紹介する。動物は、ウェイク、NREMSとレムの間で自然発生的な変遷を経る。さらに、我々は動物がこれらの遷移を経る間optogenetic刺激を適用することができます。データは、乳酸オキシダーゼベースのバイオセンサーの読み出しにその自発および誘発両波の影?...

<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>バシマウスガイドカニューレ</td><td>ピナクル技術/バシ株式会社</td><td> 7032 </td><td></td></tr><tr><td>乳酸バイオセンサー</td><td>ピナクルテクノロジー</td><td> 7004 </td><td></td></tr><tr><td>ヘッドマウント</td><td>ピナクルテクノロジー</td><td> 8402 </td><td></td></tr><tr><td>スリープ/バイオセンサー録画システム</td><td>ピナクルテクノロジー</td><td> 8400-K1-SL </td><td> 2チャネル脳波、筋電図バイオセンサ1チャネル、＆1 </td></tr><tr><td>テザーマウスのin vitroキャリブレーションキット</td><td>ピナクルテクノロジー</td><td> 7000-K1-T </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバガイドカニューレ</td><td>プラスチック一</td><td> C312G </td><td> 21ゲージガイドカニューレ</td></tr><tr><td>ダミーカニューレ</td><td>プラスチック一</td><td> C312DC </td><td> 21ゲージのダミー</td></tr><tr><td>ダイヤモンドファイバースクリーブ</td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバコネクタの圧着工具</td><td> Thorlabs </td><td> CT042 </td><td></td></tr><tr><td>分岐チューブ</td><td> Thorlabs </td><td> FT030 </td><td> 03.0ミリメートル</td></tr><tr><td></td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td>最大径。 0.012 </td></tr><tr><td>分岐チューブストリッパー</td><td> Thorlabs </td><td> FTS3 </td><td></td></tr><tr><td>裸のハードクラッドマルチモードファイバ</td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> 200μmコア、0.37 NA </td></tr><tr><td>ワイヤー切れ端/ケブラーばさみ</td><td> Thorlabs </td><td> T865 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバエポキシ</td><td> Thorlabs </td><td> F112 </td><td></td></tr&gt; <tr><td>ファイバーストリッパーツール</td><td> Thorlabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス研磨板</td><td> Thorlabs </td><td> CTG913 </td><td></td></tr><tr><td>ゴム製研磨パッド</td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td></td></tr><tr><td>アイルーペ</td><td> Thorlabs </td><td> JEL10 </td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td> Thorlabs </td><td> KW32 </td><td></td></tr><tr><td>圧縮空気</td><td> Thorlabs </td><td> CA3 </td><td></td></tr><tr><td>研磨パック</td><td> Thorlabs </td><td> D50-XX </td><td></td></tr><tr><td>ファイバースコープ検査</td><td> Thorlabs </td><td> CL-200 </td><td></td></tr><tr><td>研磨フィルム</td><td> Thorlabs </td><td> LFG5P、LFG3P、LFG1P、LFG03P </td><td></td></tr><tr><td> FC / PCコネクタ·エンド</td><td> Thorlabs </tD&gt; <td> 30126G2-240 </td><td> 240μmの内径は、SSフェルール</td></tr><tr><td> MCの刺激部本体</td><td>マルチチャネル·システム</td><td> STG-4002 </td><td></td></tr><tr><td> MCのスティミュラス·ソフトウェア</td><td>マルチチャネル·システム</td><td> MC-スティミュラスV 2.1.5 </td><td></td></tr><tr><td>青色レーザー</td><td> CrystaLaser </td><td> CL473-050から0 </td><td></td></tr><tr><td>レーザ電源</td><td> CrystaLaser </td><td> CL2005 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバーロータリージョイント</td><td>ドリス式レンズ</td><td> FRJ-V4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2消耗品と備品。 </td></tr></tbody></table>

simultaneous electroencephalography, real-time measurement of lactate concentration and optogenetic manipulation of neuronal activity in the rodent cerebral cortex

脳は質量体の5％未満を表しますが、それが残り1でボディによって使用されるグルコースの約4分の1を利用しています。非レム睡眠（NREMS）、時間によって睡眠の最も大きい部分の機能は不明である。しかし、NREMSの一つ顕著な特徴は、覚醒〜2-4相対脳グルコース利用率の大幅な削減が挙げられます。これと他の所見は、睡眠は脳代謝に関連する機能を果たすことを広く開かれた信念につながっている。まだ、NREMS時の脳グルコース代謝の減少のメカニズムは解明されていない。 脳代謝率に影響を与える可能性があるNREMSに関連付けられている一つの現象は、脳波5,6で、徐波、4 Hz未満の周波数で振動の発生である。頭蓋骨や脳皮質表面のレベルで検出されたこれらの遅い波が反映脱分極/アップ状態とダウン/過分極状態7の間の基本的なニューロンの振動。ダウン状態の間、細胞は数百ミリ秒までの間隔で活動電位を受けない。活動電位への後続のイオン濃度勾配の復元はセル8に著しい代謝負荷を表す; NREMS伴うダウン状態の間の活動電位の欠如は目を覚ますと比較して減少代謝に寄与することができる。 二つの技術的な課題は、テストするこの架空の関係のために解決しなければならなかった。まず最初に、それは（秒ではなく分かけて）脳脳波のダイナミクスの反射時間分解能で脳の解糖代謝を測定する必要があった。そうするために、我々は、乳酸の濃度、好気的解糖の製品、したがって、マウスの脳内グルコース代謝率の読み出しを測定した。ラクだった前頭葉に埋め込まれた乳酸オキシダーゼベースのリアルタイムセンサを用いて測定。感知機構は、乳酸オキシダーゼ分子の層に囲まれた白金イリジウム電極で構成されています。乳酸オキシダーゼによる乳酸の代謝は、プラチナイリジウム電極に電流を生成する過酸化水素を生成します。だから脳糖のランプアップその後検出電極に電流を増加に反映されている乳酸酸化酵素の基質濃度の増加を提供しています。それはNREMSの他の側面からこの変数を単離するために、大脳皮質の興奮性を操作しながら、これらの変数を測定するために追加的に必要であった。 我々はelecetroencephalogram、乳酸バイオセンサーを経由して解糖流量の測定、PYRAのoptogeneticの活性化を介して大脳皮質神経活動の操作を介した神経細胞活動の同時測定のための実験系を考案midalニューロン。我々は、睡眠関連の脳波波形および大脳皮質における乳酸濃度の瞬間から瞬間の動態との関係を文書化するために、このシステムを利用してきた。プロトコルは、自由にげっ歯類を行動に、脳波レベルで測定された神経活動と脳内の細胞エネルギー代謝との関係の研究に興味を持って、個々の役に立つかもしれません。

<html> 図2に示すように、 脳波、筋電図や脳乳酸濃度を連続的に監視している間optogenetic刺激と脳波/乳酸/ EMGデータ収集のために装備マウスは自発的睡眠/覚醒状態遷移を行った。乳酸センサーの電流は脳波の低振幅の期間中に増加し、脳波の高振幅の期間中に減少した。 図3に示すように、EEGの両方のチャネルが前頭皮質で配信optogenetic刺激に応答する。 <...

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

手順は脳波、筋電図、脳乳酸濃度が監視されながらoptogenetically大脳皮質錐体ニューロンの活動を操作するために記述されている。彼らは自発的睡眠/覚醒サイクルを受けながら、実験的な録音はケーブルつながマウスで実行されます。 Optogenetic機器は、我々の研究室で組み立てられている記録装置は市販されている。

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

simultaneous-electroencephalography-real-time-measurement-lactate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.1K ビュー.  Washington State University. 手順は脳波、筋電図、脳乳酸濃度が監視されながらoptogenetically大脳皮質錐体ニューロンの活動を操作するために記述されている。彼らは自発的睡眠/覚醒サイクルを受けながら、実験的な録音はケーブルつながマウスで実行されます。 Optogenetic機器は、我々の研究室で組み立てられている記録装置は市販されている。

ビデオ: Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

齧歯類の脳における同時fMRIと電気生理学

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

神経科学

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic field pulses. The initiation of cortical activation or its modulation depends on the background activation of the neurons of the cortical region activated, the characteristics of the coil, its position and its orientation with respect to the head. TMS combined with simultaneous electrocephalography (EEG) and neuronavigation (nTMS-EEG) allows for the assessment of cortico-cortical excitability and connectivity in almost all cortical areas in a reproducible manner. This advance makes nTMS-EEG a powerful tool that can accurately assess brain dynamics and neurophysiology in test-retest paradigms that are required for clinical trials. Limitations of this method include artifacts that cover the initial brain reactivity to stimulation. Thus, the process of removing artifacts may also extract valuable information. Moreover, the optimal parameters for dorsolateral prefrontal (DLPFC) stimulation are not fully known and current protocols utilize variations from the motor cortex (M1) stimulation paradigms. However, evolving nTMS-EEG designs hope to address these issues. The protocol presented here introduces some standard practices for assessing neurophysiological functioning from stimulation to the DLPFC that can be applied in patients with treatment resistant psychiatric disorders that receive treatment such as transcranial direct current stimulation (tDCS), repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), magnetic seizure therapy (MST) or electroconvulsive therapy (ECT).

The protocol presented here is for TMS-EEG studies utilizing intracortical excitability test-retest design paradigms. The intent of the protocol is to produce reliable and reproducible cortical excitability measures for assessing neurophysiological functioning related to therapeutic interventions in the treatment of neuropsychiatric diseases such as major depression.

結合された経頭蓋磁気刺激と背外側前頭前野の脳波

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...