この作品は、国立衛生研究所（NIH）の助成DA030396によってサポートされていました。役立つ議論と原稿の批評のためにDrenanラボのメンバーに感謝します。 MIへの特別な感謝は成体マウスの脳スライスに関する助言のための技術支援とジョナサン·トーマスティンのために金を実行しました。

1。脳切片の調製と電気生理学のための溶液の調製<ol><li>脳スライスの準備のためのソリューションは、以前3,4を記載した。 93 N-メチルD-グルカミン、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、30のNaHCO 3、20 HEPES、25：N-メチルD-グルカミン（NMDG）ベースの以下の組成の切断および復旧ソリューション（mm）を準備グルコース、5 Na +のアスコルビン酸塩、チオ尿素2、3 Na +のピルビン酸、硫酸マグネシウム10 4•7H 2 O 0.5のCaCl 2•2H 2 O NMDGで300から310 mOsmに調整してください。 10 N HClで7.3から7.4にpHを調整する。 <ol class="lalpha"><li>各2Mの原液を作るためにミリポア水にし、MgSO 4•7H 2 OおよびCaCl 2•2H 2 Oに溶解する。 </li><li>記載されているために、他の成分を秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、埋めるミリポア水でメスフラスコ。 </li><li> pHを測定し、10 N HClで調整してください。 </li><li>浸透圧を測定し、必要に応じてNMDGで調整します。 </li></ol></li><li> 92のNaCl、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、30のNaHCO 3、20 HEPES、25グルコース、5のNa +アスコルビン酸、2チオウレア、3 NA：以下の組成の人工脳脊髄液（ACSF）を（mMで）保持HEPESを準備+ピルビン酸、2し、MgSO 4•7H 2 O 2のCaCl 2•2H 2 Oスクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。 <ol class="lalpha"><li>記載されている順序でコンポーネントを秤量し、溶解させるために撹拌しながら、部分的にミリポア水で満たされてメスフラスコに加える。すべてのものが追加されたら、ミリポア水でメスフラスコを埋める。 </li><li> pHを測定し、必要に応じてNaOHまたはHClで調整してください。 </li><li>浸透圧を測定し、必要に応じて、スクロースで調整します。 </li></ol></li><li> 124のNaCl、KClを2.5、1.2のNaH 2 PO 4、24のNaHCO 3、12.5グルコース、2し、MgSO 4•7H 2 O 2のCaCl 2•2H 2 O：次の組成（mMで）の標準ACSF録音ソリューションを準備スクロースと300から310 mOsmに調整してください。 1NのHClまたはNaOHで7.3から7.4にpHを調整する。 </li></ol> 2。急性脳スライスの調製<ol><li>脳切片の切断および復旧は、前述の3と4を行っています。 95％酸素/ 5％CO 2ガス（carbogen）、氷上で1皿、33で他の℃までとリカバリソリューションをNMDGでいっぱい泡二つの結晶皿</li><li>バブル1水晶皿は室温でcarbogenとACSFを保持HEPESでいっぱい。 </li><li> Na +のペントバルビタール（200 mg / kgを腹腔内）で成体マウス（2〜12ヶ月熟成）麻酔。動物がつま先ピンチへの応答を全く持っていないときの手順に進みます。 </li><li>必要に応じて、後でgenotypの末尾の組織サンプルをカット動物のING。 </li><li>胸腔を開いて心臓を露出し、下行大動脈をクランプします。右心房を裂く。 </li><li> Transcardially 0〜4℃NMDGリカバリ·ソリューションの5〜10 mlの動物を灌流する。 </li><li>動物の首を、脳を除​​去し、1分間4℃NMDGリカバリ·ソリューションに配置します。 </li><li>氷のように冷えた金属板に、関心のある領域を含むように、所望の配向（等、水平、矢状、冠状）で脳をトリミング。 </li><li>接辞振動スライサーの乾燥ステージ表面に瞬間接着剤で脳ブロック（DSK-ゼロ1; Dosaka）、4水没脳ブロックcarbogenと℃のNMDGリカバリ·ソリューション、そして継続的にバブルソリューション。 </li><li>興味のある脳領域のスライ​​スをカット。スライスの厚さは、特定の興味のある脳領域、動物の年齢、および実行する実験に応じて、200〜400μmである。 </li><li>すぐに切断後、carbogenatedで所望のスライス、33℃でインキュベートNMDG回復soluti正確に12分間で、その後60分の最初の期間のためのソリューションを保持carbogenated、室温のHEPESに転送されます。この60分間のインキュベーション後、スライスが記録のために使用することができます。スライスは、彼らがレコーディングに使用されるまで、一日を通して溶液を保持HEPESで維持されます。 </li></ol> 3。脳スライスのニューロンからパッチクランプ記録<ol><li>プログラマブル·フレイミング·ブラウンプラー（サターP-97または同等の垂直プラー）と標準パッチマイクロピペットを引き抜きます。ギガオームシールを形成するための最適なピペットは、典型的には4から6MΩの抵抗を持っている</li><li>正立顕微鏡（ニコン、FN-1）のステージ上で、録音室（ワーナー·インスツルメンツのRC-27L）に1スライスを転送します。連続して表面かん流する（1.5 - 2.0ml /分）32℃に加熱され、維持carbogenated、標準記録ACSFとスライス℃の代わりに、スライスは室温に維持することができる。 </li><li>用いて、関心のある脳領域を見つけ、センター10X空気目標（ニコンプランフルーア10X、NA 0.3; WD：16ミリメートル）。 </li><li> IR-微分干渉コントラスト（DIC）光学と赤外線電荷結合素子の近くに高速に接続40X近赤外（IR）の水浸対物レンズ（3.5ミリメートル;：; WD 0.80 NAニコンAPO 40XW）を使用して、個々の神経細胞を可視化する（CCD）ビデオカメラ（浜松ホトニクスC-7500）。 IR-DIC観察下で、健康なニューロンは滑らかで、明るい灰色の形質膜を示す。 </li><li>適切な細胞内記録液でマイクロピペットを埋める。 135カリウム、グルコン酸、5のEGTA、0.5 CaCl 2で 、2のMgCl 2、10 HEPES、2のMg-ATP、0.1 GTP（pHはトリス塩基、浸透圧で7.25に調整する：ほとんどのアプリケーションでは、我々は次のソリューション（mm）を使用290スクロースmOsm）に調整。可視化ニューロンからホールセル記録を確立します。 </li></ol> 4。スライスのニューロンへの薬物のローカルアプリケーション<ol><li>上記のように標準のパッチクランプマイクロピペットを引き抜きます。使い方複数の薬剤溶液が同じセルで使用されるとき、例えば、ガラスの同じ部分からの2同一の &quot;妹&quot;のヒントを生成サッター、P-97などピペットプラーは有利である。それらは、上述の細胞内液を充填した場合MΩ〜5の抵抗を持っているでしょう先端サイズが最適です。 </li><li>埋め戻しcarbogenated、標準記録ACSFで希釈した薬剤の溶液でマイクロピペット。下向きの先端をポイントして、ソリューションの列に閉じ込められた気泡を除去するために薬剤を充填したマイクロピペットをはじく。 </li><li>そのようなPicospritzerⅢ（総合バルブ株式会社）などの適切な圧力噴射システムにチューブで接続されたピペットホルダ内の薬物を充填したマイクロピペットをマウントしてください。ピペットホルダは、一般的にパッチクランプ記録（例えば、サッターMP-285）に使用されるマニピュレータと同じ分解能を持つマイクロマニピュレータに取り付けなければならない。また、マニピュレータはに、スライスのうち、斜め移動を考慮するべきです。マンually流体の列の後ろに十分な圧力を構​​築するために3〜4倍のマイクロピペットに圧力を取り出します。 </li><li> IR-DIC光学の下に先端を可視化しながらマイクロマニピュレータのコントロールを使用して、スライスに薬物ピペットを下げる。理想的には、視覚的に識別し、センター前のスライスに記録マイクロピペットを下げる細胞近傍の薬物ピペットの位置決めが続くから記録されるニューロンがあります。薬物ピペットを合わせると、薬物ピペットがgigaohmシールを確立後に所定の位置に移動された場合は、記録が中断される可能性が記録された細胞の周辺に組織の動きを引き起こす可能性があります。 </li><li> IRのビデオを使用して、組織切片の上面に薬物マイクロピペットを位置付ける。 1圧力駆とモニタ1）の排出に関連する破片の動きのための先端付近、及び先端が詰まっているかブロックされている兆候がないか2）マイクロピペットチップを実行します。先端がブロック/目詰まりしている場合は、pipettを撤回eと新しいものと交換してください。 </li><li>このような最終的な位置に、薬剤を充填したピペットの先端が記録されたセルと記録電極の先端と同じ焦点面（またはそれより少し下）に）が1のとき、そのスライスの上部から斜めに記録されたセルに近づく記録されたセルから、2）は10〜40μm。薬剤を充填したピペットチップ、記録されたセルの上にある場合、圧力放出から力がgigaohmシールを混乱させる可能性があります。 </li><li>電圧クランプモードまたは電流クランプ·モードのセルを保持しつつ、所望の細胞応答を記録します。我々は日常的にアセチルコリンを記録および/または電圧クランプ·モードのニューロンを保持したまま、携帯電流をニコチン誘発した。 Picospritzer IIIを用いたときの圧力吐出が手動で起動することができますが、より再現性のある結果を得るためには、デジタルTTLパルスで取得システム（アクソンDigidata 1440とpClamp 10.3）を使用して圧力吐出をトリガすることをお勧めします。 </li></ol> 5。制御圧電トランスレータを使用した薬剤を充填したマイクロピペット<ol><li>可能であれば、その後でアナログ電圧入力を受け入れることができる一次元圧電変換器（ 例えば Piezojena、PA-100またはバーレイPZM-150）（再び、アクイジション·システムから）、に薬物を充填したピペットホルダをマウント高精度マイクロマニピュレーター（サッターMP-285）の上に取り付けられた。圧電トランスレータは入口/出口のタイミングや速度などのスライスの薬剤を充填したピペット内外への移動に便利ですので、より容易に制御、実験に実験から再生することができる。ピペットが圧力のみの吐出の瞬間のための圧電トランスレータを用いて細胞の近くに移動されたときnAChRsを勉強するとき、薬剤を充填したピペットからニコチン漏れの減感効果は、彼らがこれまで発生した場合、最小化されます。 </li><li>圧電電圧制御アンプ上で手動で制御されたポテンショメータを使用して、電圧をダイヤルその最大値に設定します。 </li><li>マイクロマニピュレータ、ピペット位置が記録されたセルにその中身を取り出し、手動圧電電圧制御アンプ上ゼロに電圧を低減することによりピペットを撤回するスライスにおける薬剤を充填したピペットを用いて。 </li><li>記録収集システムからのアナログ出力信号を用いて、圧力吐出TTLパルスが発生する前に、300ミリ秒を開始する250ミリ秒の期間にわたってスライスに薬剤を充填したピペットを移動します。 TTLパルスの終了後50ミリ秒を開始し、250ミリ秒の期間にわたってピペットを収納してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+activation+of+?4*+receptors:+sufficient+for+reward,+tolerance,+and+sensitization.">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li><li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized,+high-affinity+?6*+nicotinic+acetylcholine+receptors.">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li><li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li><li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction.">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li><li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum.">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li><li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons.">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li><li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+?4*+nicotinic+receptors:+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path.">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li><li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+selectively+enhances+?4?2*+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway.">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li><li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior.">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li><li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+&#945;6&#946;4*+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by &#945;6&#946;4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li><li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+&#945;4&#946;2*-,+&#945;6&#946;2*-,+&#945;3&#946;4*-+and+&#945;7-nicotine+acetylcholine+receptors.">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native &#945;4&#946;2*-, &#945;6&#946;2*-, &#945;3&#946;4*- and &#945;7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li><li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+trafficking,+pentameric+assembly,+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+&#945;6+and+&#946;3+subunits.">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled &#945;6 and &#946;3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li><li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons.">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li><li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area.">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors.">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li><li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons.">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222 (2010).</li><li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ventral+tegmental+area+revisited:+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons.">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li><li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex.">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li><li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons.">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li><li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus.">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li><li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors.">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li></ol>

本論文で提示した方法は、脳スライス標本におけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するために広く便利です。しかし、かなりの実験データは、このメソッドを利用した結果としての品質と再現性に影響を与える要因がいくつかあります。例えば、誘発電流は、薬剤を充填したピペットの先端の直径に非常に敏感です。小さなヒントを吐出する薬液の難しさの原因となり、低抵抗?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-メチルD-グルカミン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KClを</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;のNaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;炭酸水素ナトリウム<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ブドウ糖</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NA<sup&gt; +</sup&gt;アスコルビン酸塩</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;チオ尿素</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NA<sup&gt; +</sup&gt;ピルビン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マグネシウム<sub&gt; 4</sub&gt;•7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;塩化カルシウム<sub&gt; 2</sub&gt;•2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaClを</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NA<sup&gt; +</sup&gt;ペントバルビタール</td&gt;<td&gt; Vortech医薬品</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;グルコン酸カリウム</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;のMg-ATP</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdスライサーを振動&gt; DSK-ゼロ1</td&gt;<td&gt;テッド·ペラ社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 /ブラウンマイクロピペットプラー燃える</td&gt;<td&gt;サター</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27の録音室</td&gt;<td&gt;ワーナー</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B灌流ヒータコントローラ</td&gt;<td&gt;ワーナー</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27Bソリューションヒーター</td&gt;<td&gt;ワーナー</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ニコンFN-1</td&gt;<td&gt;ニコン</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCDビデオカメラ</td&gt;<td&gt;浜松</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt;一般的なバルブ株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285マニピュレーター</td&gt;<td&gt;サター</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100ピエゾトランスレータ</td&gt;<td&gt; piezosystemイエナ株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40ピエゾアンプ</td&gt;<td&gt; piezosystemイエナ株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt;モレキュラーデバイス株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt;モレキュラーデバイス株式会社</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices

タバコの使用は、がん、心臓病、肺気腫、脳卒中を含む多数の健康上の問題につながる。喫煙への依存症は、中枢神経系全体のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）ニコチンの生物物理学的および細胞作用に由来する流行精神神経疾患である。ニコチン中毒に関連する脳領域に存在するさまざまなnAChRをサブタイプを理解することは、主要な優先事項です。 このような全細胞パッチクランプまたは二電極電圧クランプ記録として電気生理学的手法を採用した実験では、目的のnAChRsの薬理学的特性評価のために有用である。このような哺乳動物組織培養細胞やアフリカツメガエル卵母としてnAChRsを発現する細胞は、物理的に分離されているので、簡単に現代の薬理学のツールを用いて研究されている。標的受容体が既に知られていた場合は特に多くの進歩は、これらの技術を用いて製造されていますND異所性発現は容易に達成された。急性実験用マウスまたはラットから採取した脳スライス内のニューロンに：多くの場合、しかし、それは彼らのネイティブ環境でnAChRsを検討する必要がある。例えば、α4L9&#39;Aマウス1およびα6L9のMICE 2として&quot;過敏&quot; nAChRをサブユニットを発現するマウスは、特定のnAChRをサブユニットのそれぞれの機能発現に基づいて神経細胞の明確な識別を可能にします。脳スライスのニューロンからホールセルパッチクランプ記録を日常的に熟練した電気生理学者によって行われていますが、局所的に、アセチルコリンや脳スライス内に​​記録された細胞にニコチンなどの薬物を適用するために挑戦している。 superfusateに薬の希釈（浴アプリケーション）は、急速に可逆的ではなく、U字管のシステムを容易に脳スライスで動作するように適合されていない。 本稿では、急速に大人メートルで記録ニューロンにnAChRを活性化薬を適用するための方法を説明します脳スライスをウーズ。標準細胞全体の録音は、スライスのニューロンから作られており、興味のある薬剤を充填した第二マイクロピペットは記録セルに近い位置に操縦される。薬剤を充填したピペットに加圧された空気または不活性窒素の注入は、記録されたセル上にピペットから吐出される薬液の少量を引き起こす。この方法を使用して、nAChRを媒介電流は、ミリ秒の精度で解決することができるようになりました。医薬品申請時間は簡単に変えることができ、薬剤を充填したピペットは、単一ニューロンのために作成される濃度応答曲線を可能にする、新しいピペットで後退して交換することができます。 nAChRを神経生物学の文脈で説明しているが、この技術は、脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルや受容体の多くの種類を研究するための有用なはずである。

我々の実験では、我々は日常的にドーパミン（DA）産腹側被蓋野（VTA）と黒質緻密部（SNC）のニューロンをから記録します。電圧固定モードでは、これらの細胞にアセチルコリンやニコチンの圧力アプリケーションでは、通常100から200ミリ秒（ 図1A-B）内にピークに達した迅速、内向き陽イオン電流になります。電流の減衰は、主に作​​用部位からの薬物の拡散によって決定さ?...

Watch this Scientific Journal Video about Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

local-application-drugs-to-study-nicotinic-acetylcholine-receptor

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Cholinergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

19.2K ビュー.  Purdue University. 本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。

ビデオ: Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

神経科学

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2. Consequently, investigation of structural details of the interaction between 5-HT2A and mGlu2 affecting schizophrenia-related behaviors represents a powerful translational tool. As previously shown, the head-twitch response (HTR) in mice is elicited by hallucinogenic drugs and this behavioral response is absent in 5-HT2A knockout (KO) mice3,4. Additionally, by conditionally expressing the 5-HT2A receptor only in cortex, it was demonstrated that 5-HT2A receptor-dependent signaling pathways on cortical pyramidal neurons are sufficient to elicit head-twitch behavior in response to hallucinogenic drugs3. Finally, it has been shown that the head-twitch behavioral response induced by the hallucinogens DOI and lysergic acid diethylamide (LSD) is significantly decreased in mGlu2-KO mice5. These findings suggest that mGlu2 is at least in part necessary for the 5-HT2A receptor-dependent psychosis-like behavioral effects induced by LSD-like drugs. However, this does not provide evidence as to whether the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex is necessary for this behavioral phenotype. To address this question, herpes simplex virus (HSV) constructs to express either mGlu2 or mGlu2&#916;TM4N (mGlu2/mGlu3 chimeric construct that does not form the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex) in the frontal cortex of mGlu2-KO mice were used to examine whether this GPCR heteromeric complex is needed for the behavioral effects induced by LSD-like drugs6.

This article describes how to inject viral vectors into the mouse frontal cortex to test behavioral assays that require GPCR heteromeric formation.

マウスにおけるGPCRヘテロマーの行動機能を研究するためのキメラ構築物のHSV媒介導入遺伝子発現

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

脳スライスにおける GABA のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ex Vivoラット脳切片を用いた神経変性疾患の主要なイベントを勉強する方法

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

活性型のニコチンのレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法によるマウス脳切片でのニコチン性アセチルコリン受容体の機能を探る

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

子供の脳磁図を用いた脳機能の研究

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

成人小脳スライスにおける長期うつ病誘導の評価

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

要約

さらに動画を探す

PLAYLIST