光学顕微鏡は、サンプルを拡大して観察するための装置です。光学顕微鏡を利用するとサンプルを１０００倍まで拡大して観察することができ、非常に有用な解析ツールとなります。光学顕微鏡の操作は簡単で、多くの実験に用いることができる優れものです。
名前からも分かるように光学顕微鏡には光源があり、コンデンサレンズを用いることでサンプルに焦点を当てることができます。
サンプルに照射された光は、対物レンズに達し倒立の拡大像が作り出されます。接眼レンズによりさらに拡大された像が作られ、それを観察することができます。光路にさらなる光学部品を配置することで正しい向きの像を観察できます。このように複数のレンズが組み合わされた顕微鏡のことを複合顕微鏡と呼びます。
複合顕微鏡の倍率は、対物レンズの倍率と接眼レンズの倍率を掛け合わせた値になります。例えば40倍の対物レンズと10倍の接眼レンズを使用するときの総合倍率は400倍です。
顕微鏡下で物体の大きさを推定するために、視野にスケールを映し出すレチクルを使用します。高倍率にすると、レチクルの一目盛りは、低倍率のときと比べて小さくなります。
倍率に加え、分解能も顕微鏡の重要な要素となります。分解能とは、顕微鏡下で微小な2点を識別可能な最小の距離のことです。これらキャラクターの頭がはっきり見えるほど、分解能が高いと言え、彼らを識別できる最小距離は小さくなります。
光学顕微鏡の基本となるパーツは、対物レンズ、接眼レンズ、サンプルをのせるステージとホルダー、光源、視野絞り、コンデンサと開口絞り、粗野及び微動ハンドルです。
中でも対物レンズは、倍率と分解能を決める最も重要な機器です。回転式のレボルバーに取り付けることで、焦点面を変えずに、つまり焦点を合わせたままでレンズを切り替えることができます。対物レンズには、倍率、対物レンズの開口数すなわちNA、液浸用の液体の種類、使用すべきカバーガラスの厚さ、作動距離つまり焦点を合わせた時のレンズ先端からサンプルまでの距離が記載されています。
開口数又はNAによって、対物レンズがどれだけ多くの光を取り入れられるかが決まります。開口数が大きいほど、広範囲の光を集められ、小さいほど直斜光のみが取り入れられます。対物レンズの分解能は、波長と開口数から求めることができます。
光源、視野絞り、開口絞り、コンデンサによって、サンプルに照射する光が作り出されます。
一般的な光源は、低電圧ハロゲンランプで、光強度を調整することができます。光は様々なフィルターを通過し、視野絞りでサンプルにあたる光の範囲を調整できます。通過した光はコンデンサによって集められ、サンプルに照射されます。照射される円錐状の光はコンデンサを使ってコントロールでき、使用する対物レンズに応じて調整する必要があります。
実際に光学顕微鏡を使ってみましょう。まずはサンプルを顕微鏡のステージの上に置き、観察対象物が対物レンズの真下にくるようにクリップで固定します。
次に、光源のスイッチを入れ、低倍率の対物レンズを選択します。
対物レンズを粗動ハンドルを使ってステージから遠ざける方向に動かしピントを合わせます。次に微動ハンドルを使ってしっかりとピントを合わせます。このときスライドやステージに接触してレンズを破損しないように注意してください。
接眼レンズを覗いて、ハンドルで調整しながらスライドを動かし観察ポイントを見つけ出します。低倍率から高倍率に切り替えると、視野は大幅に狭くなります。低倍率の対物レンズの真下で観察ポイントを決定してから、高倍率の対物レンズに切り替えることで、目的の検体を見つけやすくなります。
低倍率でフォーカスしたあとに高倍率に切り替える方法で、画像を取得してください。
照明を最適化するには、最初に視野絞りを使ってしぼり自体が視野に入り込まないようにセットします。
次に、コンデンサ絞りを調整し、対物レンズの開口数と一致させます。
最後にもう一度ピントを合わせます。このときは微動ハンドルのみを使用して下さい。これで画像が取得できました。
光学顕微鏡は、いろいろなサンプルの観察を可能にする機器であり、用途に応じて最適化された様々な複合顕微鏡があります。
これは手術用顕微鏡での作業準備をしているところです。この顕微鏡は可動式のアームに取り付けられており、立体視観察ができます。また、顕微鏡にはカメラが搭載されています。この手術用顕微鏡は、マウスへの腎移植を行う際に用いられます。
ここでは、研究者が解剖顕微鏡を覗きながら、ショウジョウバエの幼虫を選別しています。その後解剖して体壁筋を完璧に取り出し、神経筋接合部の研究を行います。
これは倒立顕微鏡です。対物レンズはステージの下に配置されており、マイクロインジェクション法に対応できます。体細胞核移植として知られるこの手法は、トランスジェニック動物やクローンを作製するための重要なテクニックです。
ここまでJoVE光学顕微鏡編をご覧いただきました。このビデオでは、光学顕微鏡の概要、使用方法、構造、調整の仕方、画像の取得方法を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。
