著者らは、タンパク質マイクロアレイの開発の支援のためにマリアモントン、ジュリーLebert、ジェサミンリトル、新Ge及びローラLautensに感謝します。また、作者はこの仕事に資金を供給するための自​​然科学とカナダの工学研究会（NSERC）に感謝。また、作者はこの仕事をサポートするためのイノベーションとオンタリオ州イノベーショントラストのためカナダ財団に感謝します。 JDBは、バイオ分析化学とBiointerfacesにおけるカナダリサーチチェアを保持しています。

<ol>
	<li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination.">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li><li>Zhu, H. H., Bilgin, M. 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我々は、開示することは何もありません。

ここで説明する方法は、急速な材料の多数をスクリーニングすることなく、最適な材料を識別するための時間および費用対効果を生成する手順、コンタクトプリンタで印刷可能なゾル - ゲル由来の材料を識別するために最も適しとして選択した。 〜20,000電位の材料の合計から、単独でゲル化時間に基づいて、印刷に適していた200〜物質を同定することが可能であった。これは、大幅に後続の印刷試験のために準備する必要な材料の数を減少させた。これらの印刷可能な材料は、次いで、768スライド用材料の組み合わせの合計4摺動面上に印刷した。平均して、一つの材料の50スポット/複製は、サンプルローディング、スポット堆積とピンクリーニングを含む2〜3分で印刷することができます。これらのうち、155の材料、または約20％であり、溶液の取り込みごとのスポットの最大数を印刷するために許可され、再現性のスポットサイズを生じた。なお、4 SLとIDE面は、順番に、より良い印刷物テスト：アミン&gt;エポキシ&gt;アルデヒド&gt; PMMAを、PMMAスライドを任意の材料のために有用な配列を生成しなかった。これは、おそらく表面コーティングの極性に起因するものであった。前述の摺動面を比較すると、より極性アミンとエポキシが良いPMMAスライドに比べ、水性ゾルに適していた。さらに、テスト表面の、アミン被覆スライドは、債券へのアニオン性のゾルを堆積するための潜在的な、正に帯電した表面を提供する。私たちは、疑う、スライドとゾルの間の界面におけるシリカナノ粒子は、表面に沿って対話します。エポキシおよびアルデヒド摺動面の両方が同じ初期電荷ベースの相互作用を欠いている。最適なスポット堆積を確保するためにそれは非常なArrayitなどのサプライヤーからプレコートスライドを使用することをお勧めします。社内のコーティングが悪いスポット再現性13とにつながる矛盾したサーフェスを生成、いくつかのケースでは、定量化の確率につながる可能性があります題。等しく重要なのは18、温度と湿度は、材料の&quot;適性&quot;を影響します。温度に関連する影響に関する詳細な研究が行われなかったものの、印刷が常に（23±3℃）を室温で行った。湿度（80％以上）は、小さな堆積量（nlの0.7から2.3）および蒸発による不規則な形状の堆積を防止するために、印刷チャンバ内に制御した。 材料画面はアセチルコリンエステラーゼおよびキナーゼ、タンパク質の両方のタイプのために働いた材料の小さなセットを同定したの印刷用に特別に最適なゾル - ゲル由来材料を特定の方に導かれていたが。実際、キナーゼマイクロアレイの製造のために識別された材料の両方がSS + PVA +グリセロールに基づいていた、両方の材料はまたマイクロアレイのAChEのために選択材料26内に同定された。これらの &quot;最適な&quot;材料はさらにproteを開発するための一般的な出発点を提供することがありますでドープされたゾル - ゲルベースの​​マイクロアレイ、およびこれらの組成物を中心とした小さな画面では、マイクロアレイの製造のためのより良い材料を識別することができる。注意すべき第二の点は、使用する酵素の重要性である。アセチルコリンエステラーゼ（むしろ堅牢な酵素）の場合には、アッセイ互換として識別原稿66の材料26（又は約40％）が捕捉されたアセチルコリンエステラーゼの活性を保持していた。しかし、より繊細69アッセイ互換組成物のわずか2キナーゼ、または材料の約3％のために、すべてのキナーゼの活性を保持することができた。異なる酵素の十分な数が決定的な文を作るために研究されていないが、比較的不安定な酵素で、その最適化アレイ製造表示されmutliplexedマイクロアレイの製造を可能にするために広範囲のタンパク質を捕捉することができる材料の同定につながる可能性がある。 選択されたタンパク質の独立した、印刷可能な材料を識別するための主要なカットオフ率は、長いの必要だった素材ゲル化時間（&gt; 2.5時間）。 SS系ゾル - ゲル材料を開発するとき、それは、イオン交換、濾過後に、ゾルはpH約4であることを確実にするために非常に重要である。低い初期pHのゾル酵素活性に影響を与えることができるよりも低い中性pH、を持つ材料になることがあります。19 SSにダウエックス量（イオン交換樹脂）の調整は、ゾルの最終pHを変えることができます。樹脂の新しいバッチを調製する際SSへの樹脂の比率は、プロトコルのセクション2の手順に従って、pH約4でゾルを生成するように調整する必要がある。 生体分子捕捉用DGS系ゾルを使用した場合と同様に、結晶DGSの調製は、多くの場合、材料破壊に関連付けられたエラーの原因である。 、ここでは詳細には細心の注意が報告されていないがpolyglyceratedシリカを生産する合成中の水の存在を避けるために特に必要で、結晶DGSの合成中に注意する必要がむしろ単量DGSよりTES。また、DGSの吸湿性の性質のために、結晶試料は合成後6ヶ月以内に乾燥して使用格納する必要がある。 6ヶ月以上前の結晶DGSも酸性環境における超音波処理で（せいで部分的に凝縮ポリグリセリルシリケート材料に）完全に溶解しないことがあります。不完全DGSの溶解は、未知と制御不能シリカ含有量、したがって、より少ない堅牢な材料とゾルを生成します。 コンタクトプリントで注意すべき重要な点は、ピンの品質です。破損したり、誤っピン（ 図9）が印刷されている物質の独立した再現可能な配列を作り出すことは決してありません。それは、壊れたり、詰まっピンが使用されていないことを確認するために解剖顕微鏡を用いてピンの品質をチェックすることをお勧めします。慎重な取り扱いにはピンの長寿命を保証します。ピンの自由な移動も重要である。水分が頭とピン、ピンの間にプリントヘッドの中に閉じ込めている場合で座席は正しく、したがって、材料の堆積の欠如、その結果、表面に適切な接触をすることはありませんではないでしょう。 結論として、我々は、高濃度ドープされたタンパク質ピン印刷されたマイクロアレイを開発するための詳細な多段スクリーニング法を提供している。スクリーニングは、より集中スクリーニング続い資材の印刷は、与えられた測定法との互換性と酵素活性を保持することができる物質を同定することを可能にする材料特性の最適化（ゲル化時間と印刷適性）が含まれます。この誘導物質のスクリーニング手法は、効率的な高密度マイクロアレイの製造にかかる時間とコストを削減するために追加のマイクロアレイフォーマットに適用することができる。

マイクロアレイは増加アッセイのスループットのための方法として、科学界で人気を得ています。マイクロアレイ技術の開発は、1990年代半ばにおける遺伝子発現1を評価するので、マイクロアレイは、タンパク質-タンパク質およびタンパク質-小分子相互作用を識別するために、独特の特性を有する新しい材料を見つけるためのハイスループットアッセイの開発に使用することを見出した。 2-5最近では、マイクロアレイは、適切な蛍光を用いたマイクロアレイ自体の酵素活性及び阻害の容易な測定を可能にする、特定の材料がタンパク質が捕捉される範囲内の三次元マイクロアレイ素子の製造、機能性タンパク質を固定化するために使用されることを特徴とする請求開発されている基質代謝回転に結合されているアッセイ5-10重要なことに、このようなマイクロアレイは非常に並列接続された方法で一緒に画面サンプルとコントロールに必要なすべてのコンポーネントを含むように設計することができる。5,8 &lt;/ P&gt; タンパク質マイクロアレイの初期の例は、典型的には、共有結合、11アフィニティキャプチャ3と物理吸着などの固体支持体上へのタンパク質固定化のための標準的な方法を用いて調製した。12バイオ固定するこれらの方法は、増加した試料濃度とするために必要な加速反応速度を可能にする一方でアッセイ小型化が、彼らはそれぞれの欠点に苦しむ。一般的に、すべての活性部位へのアクセスを妨げて、表面の化学修飾にネイティブ機能により生体分子の減少を引き起こすか、または非特異的な固定化のために不適切な姿勢。生体分子堆積の増加にもかかわらず、低いアッセイ感度、おそらく人工的に表面に生体分子をバインドする必要があるため、発生する応答でこのように、すべてのメソッドの結果。 機能的な生体分子マイクロアレイの生産のための新たなアプローチは、タンパク質ドープのピンプリンティングを介して行われます通常はどちらか官能ガラススライドまたはマイクロウェルプレートの個々のウェルである固体支持体上にシリカゾル、。ならびに13をロードする高タンパク質を考慮して、3次元マトリクス内に閉じ込める生体分子ゲル、複数の構成要素の挟み込み内ゾル-ゲルプロセス自体は室温で水性環境で行われ、それが印刷された液体前駆体であり、同じマイクロアレイ素子。ゾルゲル由来材料の裁縫13,14は、同様に異なるバッファの使用（pH、イオン強度）を介して水性成分を変更することにより、異なるシリカ前駆体の注意深い選択によって行われ、包含することができるの最適な材料を達成するために種々の添加剤（ポリマー、小分子）の特定の性質が捕捉される生体分子に依存する。10 ピンプリンティングを介してゾル - ゲル由来のタンパク質マイクロアレイの開発に関連する潜在的な制限があるピンでゲル化することなく、印刷または一度表面に印刷望ましくない特性（クラッキング再生不可能なスポットサイズ、接着不良、アッセイ成分との非互換性、貧しいタンパク質活性）を示すことができ、ゾル-ゲルベース複合材料を識別する必要があります。5同時これらのすべてのパラメータの最適化は、材料は、デノボ設計、またはシリアル方式でゆっくりと調べることができ、請求のアプローチを排除。一方、多くの千又は材料の数万のランダムスクリーニングも、時間も費用効果が高い。 本稿では、ランダムな材料の多数をスクリーニングすることなく、タンパク質マイクロアレイの製造に適した材料の迅速な同定を可能に向けスクリーニング手法を説明する。誘導アプローチを用いて、マイクロアレイ印刷に適した材料は、第一の最適なゾル - ゲル誘導さ、材質を識別するための小規模な一連の画面に続いて、同定さ割れや与えられたアッセイと互換性のあるなしで、再現性よく印刷することができるほかの組み合わせ。最後に、最適な材料は、最終的な小分子のスクリーニングアッセイにおける酵素活性および性能の維持に基づいて識別される。このように、最適な材料は、わずか数百アッセイ手順を使用して、何千もの候補の中から識別することができます。我々は、高密度のアセチルコリンエステラーゼ及びマルチキナーゼマイクロアレイの両方を製造するためのこのアプローチは、小分子のスクリーニングのためのそのようなマイクロアレイの使用を示す。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) (PVA)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>360627</td>
			<td>80% hydrolozyed, Mw 600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 600 (PEG)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>87333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>482595</td>
			<td>50% (w/w) solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIC2263.0</td>
			<td>25% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIT8189.0</td>
			<td>50% in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1660.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyltrimethoxysilane (MTMS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIM6560.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIB1817.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Gelest, Inc.</td>
			<td>SIA0610.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N&#949;-Acetyl-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A4021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, 1.0 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC24350-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N</td>
			<td>LabChem Inc.</td>
			<td>LC15300-2/LC152220-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diglycerolsilane (DGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium silicate solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS338-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowex 50WX8-100 ion exchance resin</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>217492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine iodide</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>1480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>C2888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY FL L-Cystine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B-20340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P33706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;triphosphate disodium salt (ATP) solution</td>
			<td>Sigma-Alderich</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>454850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38&#945;/SAPK2a (T106M), active</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-687M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor (EGFR)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen synthase kinase 3&#946; (GSK-3&#946;)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myelin basic protein (MBP)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Substrate for MAPK2 and p38&#945;, Donated by Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSM</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-533</td>
			<td>Substrate for GSK-3&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>12-440</td>
			<td>Substrate for EGFR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposy coated slides</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SME2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides</td>
			<td>Exakt Technologies Inc.</td>
			<td>41500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-&#956;m syringe filter</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtek Contact Printer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaray Fluorescence Slide Imager</td>
			<td>Alpha Innotech Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop microarray centrifuge</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ Synthesis A10</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Used to filter all water required for experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guided materials screening approach for developing quantitative sol-gel derived protein microarrays

マイクロアレイは、新素材や小分子薬物リードの発見のためのハイスループットアッセイの開発に使用することを見出した。本明細書で我々は3次元タンパク質マイクロアレイを製造するのに適しているゾル - ゲル系材料を識別するための誘導物質のスクリーニング手法を説明する。アプローチは、最初にマイクロアレイとして印刷することができる材料を識別する最大の酵素活性の保持に基づいて、特定の酵素アッセイと互換性のあるもの、および、最適な材料で上まで迫るを識別することによって、材料の数を絞り込む。このアプローチは、2つの異なる酵素アッセイに適したマイクロアレイ、アセチルコリンエステラーゼを使用して1つおよび癌に関与する4つの主要なキナーゼのセットを使用して、他の開発に適用される。それぞれの場合には、定量的な小分子のスクリーニングアッセイおよび用量依存的な阻害剤の応答曲線の製造に使用することができるマイクロアレイを製造することが可能であった。重要なのは、能力は、多くの仲間をスクリーニングするリアルでは、最高の酵素活性のマイクロアレイの生産と保持の両方を最適材料の種類についての情報を生成した。素材データは、最適な、高密度のゾル - ゲル派生マイクロアレイを調整するために必要な基本的な材料の要件への洞察を提供します。

材料画面用の誘導因子分析を行うことにより、我々は、約20,000から印刷に適したゲル化時間を有し、数百に試験した材料の数を最小限に抑えることができた。の厳格なガイドラインが必要な材料ゲル化時間を適用することにより、2.5時間以上が、印刷ピンを詰まらせたり、再生不可能な配列を生成する可能性が高い材料は印刷されませんでした。十分な（&gt; 2.5時間）ゲル化時間を有すると同定印刷可能な材料は、4つの異なる官能化ガラススライドの表面に印刷した。秩序 &quot;印刷可能&quot;と見なされるべきでは、ピンの取り込み体積あたりのスポット数は最大（SMP3を= 200）を印刷しなければならなかった。スポットは、 図2に示すように、割れまたは望ましくない相分離が単純な明視野顕微鏡を用いて発生していないことを確認するために、スポット形態について評価した。 同定され印刷可能な素材のこの段階から、マイクロアレイはアセチルコリンエステラーゼを製造し、キナーゼは、バッファリングされた水性成分に組み込む。アッセイ手順（潜在的なオーバープリントと洗濯や染色工程を含む）との互換性があった材料はネガティブコントロール（NCにマイクロアレイスポットの保持（無割れ、斑点や珍しい蛍光パターンの損失）及び陽性コントロール（PC）を観察することによって同定された等の画像を通して観察は1より大きい）比。これは材料の約50％であったとして、3以上のPC / NC比は、タンパク質の活性を保持して最適な材料を定義するために使用された。この方法によって、&gt; 3 PC / NC基準を満たしキナーゼを含むAChEの2物質を含む26ゾル-ゲル由来材料。 図3と図4は、最適のAChE及びキナーゼの同定のための5誘導物質画面ステップのグラフィカル内訳を示すそれぞれマイクロアレイ、。 アッセイもZ &#39;スコアの世代を通じて検証することができます17 </sup&gt;これは、最高のPC / NC比が製造された材料を使用して行われました。 図5は Z &#39;プロットは200箇所、100 PCとAChEのアレイ上指示薬色素と基板をオーバープリントした後100 NCから生成された信号を比較することによって得を示しています。アセチルコリンエステラーゼとキナーゼアレイは優れたアッセイを示す0.60と0.67のそれぞれのZ &#39;スコアをもたらした。しかしながら、アッセイの検証前に、オン·アレイ酵素、染料、基板と補因子の濃度が他の場所で詳細に説明するように、各成分の濃度の範囲をオーバープリントし、最も高い信号を生成した濃度を選択することによって最適化されなければならなかったことに留意すべきである5 アッセイを検証するために、定量的な阻害データが重複し、重複プロット（ 図6A）および阻害曲線（ 図6B及び図6C）を生成するために使用で行われる結果と、既知および未知のAChE阻害剤を用いて得られた。&lt;第染料と基板との既知の阻害剤又は阻害剤なしのいずれかを含む制御次いで混合物で知られている生物学的に活性な小分子阻害剤の混合物と重ねてプリントされた強い&gt;スポットが含まれていた。重複したプロットは、酵素活性を評価するために生成され、25％未満の酵素活性をもたらした任意の混合物が阻害について陽性とみなした。このような混合物から個々の化合物は、次いで阻害の原因特定の小分子（単数または複数）を識別するために、二重に試験した。一旦、識別されたこれらの小分子は、IC 50値および阻害定数を決定するために定量的な阻害曲線を生成するために使用された。 同様の定性的な結果が共通のキナーゼ阻害剤、スタウロスポリンによるマルチキナーゼアレイを用いて得られた。 図7Aおよび7Bは、マルチキナーゼを重ね刷りし、染色した後マイクロアレイ画像を表示し、その信号強度を示す（ - ATP）、ポジティブコントロール（+ ATP）と既知の阻害剤（+ ATP + INH）の配列は、ネガティブコントロールのために期待されている。マイクロアレイから定量的阻害データを取得する能力を実証するために、濃度依存的な阻害アッセイは、単一のキナーゼを行った。 図8A及び図8Bに示すように、信号強度が阻害剤濃度が増加するにつれて減少し、応答がp38α/MBPキナーゼ/基質システムの予想濃度依存的阻害曲線に従う。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> 図1。ガイド付きの材料スクリーニングアプローチのための一般的な回路図は 、 各ブロックには、順番に画面のステップを表しています。左側の数字は、分析のために調製材料の総数を表す。 2.5時間（ゲル化時間を有する材料未満で2.5時間arを超えるゲル化時間を用いてe）は取り消し線で示すように、各ステージを通過し、材料画面中に繰り越さ材料の数が右側の数字で示されている。 *最適な相分離未満の材料を表します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> 図2。スクリーン印刷適性の工程において材料の様々な故障モードを示す光学像は &quot;良い&quot;材料（第2行3列目）の画像は、比較のために示されている。参照8、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> 図3。ゾル-ゲル由来のAChEマイクロアレイを製造するための最適な材料を識別するための指向性材料スクリーニングアプローチは、パーマを得て転載文献5、著作権2013年アメリカ化学会からission。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> 図4。ゾル-ゲル由来キナーゼマイクロアレイを製造するための最適な材料の識別のためのアプローチをスクリーニング監督材料。参照8、著作権2013年のアメリカの化学会から許可を得て転載。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> 図5。 （A）HC（明るい緑色）とLC（ライトグリーン）スポット（黒緑パレットがプレゼンテーションを明確にするために擬似カラーとして適用された）を示すのAChEマイクロアレイの部と、（B）箱入りエリアの拡大図は、スポットを強調する形態およびアラインメント;及び（C）Z &#39;プロットの実線は平均値を示す<html>破線は3SDに対応しながら、複製します。文献5、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> 図6。 （A）は、ヒガンバナ科アルカロイドの合成類似のオン配列スクリーニングのためのプロットを重複し、（B）を同定可能性阻害剤のIC 50プロットは、化合物1〜25からの平均の1標準偏差を表すエラーバー付き（C）化合物2、としてマーク複製する。代表的なスポットが阻害剤濃度に比例した信号の差を説明するために示されている。文献5、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 NT &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> 図7。オン·アレイは、捕捉用1.4SS/1.0PVAを使用して、4つのキナーゼアッセイおよびアミン誘導体化されたスライド上に印刷しました。（A）キナーゼ、それぞれの基質と同時捕捉さを有するスポットを緩衝液で重ねてプリントされたマイクロアレイの断面の画像（NC、一番上の行）、またはATP（PC、中段）またはATP +スタウロスポリン（下段）を含む溶液。 （B）との間の信号強度を比較する棒グラフを抑制し、25から平均値の1標準偏差を表すバックグラウンド信号と誤差棒の減算後の制約のない反応は、レプリケート。参照8、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> 図8。 Inhibiti。p38a/MBPマイクロアレイ上でアッセイ（A）スタウロスポリンの濃度を変化させたoverspotted代表的なスポットを示したマイクロアレイの切片として（;合成画像は、明確にするために示されている画像は、同じスライドの単一のスキャンによって得た）を示した。 （B）IC 50曲線を分析配列画像から生成される。 100mMので得られた強度は、すべての画像から差し引いた他のすべての強度は、100％活性の値に10nMので得​​られた強度を設定することによって正規化した。参照8、著作権2013年米国化学会から許可を得て転載。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> 図9。様々な欠陥を示す接触ピン印刷に使用微視的ステルスピンの画像：（A）目詰まり、（B）曲がった。

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A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

製造の新たなピン印刷法を用いてゾル - ゲル由来のタンパク質ドープされたマイクロアレイを開発するための誘導物質のスクリーニング手法が記載されている。この方法は、費用対効果の高い小分子のスクリーニングのために使用されるアセチルコリンエステラーゼ及びマルチキナーゼマイクロアレイの開発により実証されている。

定量ゾルゲル由来のタンパク質マイクロアレイを開発するためのガイド材料スクリーニングアプローチ

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K ビュー.  McMaster University. 製造の新たなピン印刷法を用いてゾル - ゲル由来のタンパク質ドープされたマイクロアレイを開発するための誘導物質のスクリーニング手法が記載されている。この方法は、費用対効果の高い小分子のスクリーニングのために使用されるアセチルコリンエステラーゼ及びマルチキナーゼマイクロアレイの開発により実証されている。 

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Seeded Synthesis of CdSe/CdS Rod and Tetrapod Nanocrystals

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded synthesis strategy is used in which spherical seeds of CdSe are prepared first using a hot-injection technique. By controlling the crystal structure of the seed to be either wurtzite or zinc-blende, the subsequent hot-injection growth of CdS off of the seed results in either a rod-shaped or tetrapod-shaped nanocrystal, respectively. The phase and morphology of the synthesized nanocrystals are confirmed using X-ray diffraction and transmission electron microscopy, demonstrating that the nanocrystals are phase-pure and have a consistent morphology. The extinction coefficient and quantum yield of the synthesized nanocrystals are calculated using UV-Vis absorption spectroscopy and photoluminescence spectroscopy. The rods and tetrapods exhibit extinction coefficients and quantum yields that are higher than that of the bare seeds. This synthesis demonstrates the precise arrangement of materials that can be achieved at the nanoscale by using a seeded synthetic approach.

A protocol for the seeded synthesis of rod-shaped and tetrapod-shaped multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe is presented.

のCdSe / CdSのロッドやテトラポッドナノ結晶のシードの合成

We demonstrate a method for the synthesis of multicomponent nanostructures consisting of CdS and CdSe with rod and tetrapod morphologies. A seeded ...

化学

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell differentiation into osteoblasts, thus stimulating healing and de novo bone formation. The clinical use of recombinant human BMP-2 (rhBMP-2) in conjunction with scaffolds has raised recent controversies, based on the mode of presentation and the amount to be delivered. The protocol presented here provides a simple and efficient way to deliver BMP-2 for in vitro studies on cells. We describe how to form a self-assembled monolayer consisting of a heterobifunctional linker, and show the subsequent binding step to obtain covalent immobilization of rhBMP-2. With this approach it is possible to achieve a sustained presentation of BMP-2 while maintaining the biological activity of the protein. In fact, the surface immobilization of BMP-2 allows targeted investigations by preventing unspecific adsorption, while reducing the amount of growth factor and, most notably, hindering uncontrolled release from the surface. Both short- and long-term signaling events triggered by BMP-2 are taking place when cells are exposed to surfaces presenting covalently immobilized rhBMP-2, making this approach suitable for in vitro studies on cell responses to BMP-2 stimulation.

We describe a method for accomplishing efficient immobilization of BMP-2 on surfaces. Our approach is based on the formation of a self-assembled monolayer to achieve the covalent binding of BMP-2 via its free amine residues. This method is a useful tool to study signaling at the cell membrane.

共有結合は、自己組織化単分子膜の手法を用いて表面上のBMP-2の結合

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Synthesis and Purification of Iodoaziridines Involving Quantitative Selection of the Optimal Stationary Phase for Chromatography

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. Diiodomethyllithium is prepared by the deprotonation of diiodomethane with LiHMDS, in a THF/diethyl ether mixture, at -78 &#176;C in the dark. These conditions are essential for the stability of the LiCHI2 reagent generated. The subsequent dropwise addition of N-Ts aldimines to the preformed diiodomethyllithium solution affords an amino-diiodide intermediate, which is not isolated. Rapid warming of the reaction mixture to 0 &#176;C promotes cyclization to afford iodoaziridines with exclusive cis-diastereoselectivity. The addition and cyclization stages of the reaction are mediated in one reaction flask by careful temperature control.
Due to the sensitivity of the iodoaziridines to purification, assessment of suitable methods of purification is required. A protocol to assess the stability of sensitive compounds to stationary phases for column chromatography is described. This method is suitable to apply to new iodoaziridines, or other potentially sensitive novel compounds. Consequently this method may find application in range of synthetic projects. The procedure involves firstly the assessment of the reaction yield, prior to purification, by 1H NMR spectroscopy with comparison to an internal standard. Portions of impure product mixture are then exposed to slurries of various stationary phases appropriate for chromatography, in a solvent system suitable as the eluent in flash chromatography. After stirring for 30 min to mimic chromatography, followed by filtering, the samples are analyzed by 1H NMR spectroscopy. Calculated yields for each stationary phase are then compared to that initially obtained from the crude reaction mixture. The results obtained provide a quantitative assessment of the stability of the compound to the different stationary phases; hence the optimal can be selected. The choice of basic alumina, modified to activity IV, as a suitable stationary phase has allowed isolation of certain iodoaziridines in excellent yield and purity.

A protocol for the diastereoselective one-pot preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines is described. The generation of diiodomethyllithium, addition to N-Ts aldimines and cyclization of the amino gem-diiodide intermediate to iodoaziridines is demonstrated. Also included is a protocol to rapidly and quantitatively assess the most appropriate stationary phase for purification by chromatography.

クロマトグラフィーのための最適な固定相の定量的な選択を伴う合成とIodoaziridinesの精製

The highly diastereoselective preparation of cis-N-Ts-iodoaziridines through reaction of diiodomethyllithium with N-Ts aldimines is described. ...

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Microfluidic Pneumatic Cages: A Novel Approach for In-chip Crystal Trapping, Manipulation and Controlled Chemical Treatment

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. Herein, we introduce a microfluidic-based technology, employing a double-layer microfluidic device, which can trap and localize in situ and ex situ synthesized structures on microfluidic channel surfaces. Crucially, we show how such a device can be used to conduct controlled chemical reactions onto on-chip trapped structures and we demonstrate how the synthetic pathway of a crystalline molecular material and its positioning inside a microfluidic channel can be precisely modified with this technology. This approach provides new opportunities for the controlled assembly of structures on surface and for their subsequent treatment.

Herein, we describe the fabrication and operation of a double-layer microfluidic system made of polydimethylsiloxane (PDMS). We demonstrate the potential of this device for trapping, directing the coordination pathway of a crystalline molecular material and controlling chemical reactions onto on-chip trapped structures.

マイクロ流体空気圧ケージ：インチップクリスタルトラッピング、操作のための新しいアプローチと管理化学治療

The precise localization and controlled chemical treatment of structures on a surface are significant challenges for common laboratory technologies. ...

Synthesis of a Water-soluble Metal&#8211;Organic Complex Array

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as Ru(II), Pt(II), and Rh(III). The compound, named as a water-soluble metal-organic complex array (WSMOCA), is obtained through 1) the conventional solution-chemistry-based preparation of the corresponding metal complex monomers having a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protected amino acid moiety and 2) their sequential coupling together with other water-soluble organic building units on the surface-functionalized polymeric resin by following the procedures originally developed for the solid-phase synthesis of polypeptides, with proper modifications. Traces of reactions determined by mass spectrometric analysis at the representative coupling steps in stage 2 confirm the selective construction of a predetermined sequence of metal centers along with the peptide backbone. The WSMOCA cleaved from the resin at the end of stage 2 has a certain level of solubility in aqueous media dependent on the pH value and/or salt content, which is useful for the purification of the compound.

Synthesis of a Water-soluble Metal&amp;#8211;Organic Complex Array

A potential general method for the synthesis of water-soluble multimetallic peptidic arrays containing a predetermined sequence of metal centers is presented.

水溶性有機金属錯体アレイの合成

We demonstrate a method for the synthesis of a water-soluble multimetallic peptidic array containing a predetermined sequence of metal centers such as ...

Facet-to-facet Linking of Shape-anisotropic Colloidal Cadmium Chalcogenide Nanostructures

Here, we describe a protocol that allows for shape-anisotropic cadmium chalcogenide nanocrystals (NCs), such as nanorods (NRs) and tetrapods (TPs), to be covalently and site-specifically linked via their end facets, resulting in polymer-like linear or branched chains. The linking procedure begins with a cation-exchange process in which the end facets of the cadmium chalcogenide NCs are first converted to silver chalcogenide. This is followed by the selective removal of ligands at their surface. This results in cadmium chalcogenide NCs with highly reactive silver chalcogenide end facets that spontaneously fuse upon contact with each other, thereby establishing an interparticle facet-to-facet attachment. Through the judicious choice of precursor concentrations, an extensive network of linked NCs can be produced. Structural characterization of the linked NCs is carried out via low- and high-resolution transmission electron microscopy (TEM), as well as energy-dispersive X-ray spectroscopy, which confirm the presence of silver chalcogenide domains between chains of cadmium chalcogenide NCs.

A protocol detailing how shape-anisotropic colloidal cadmium chalcogenide nanocrystals can be covalently linked via their end facets is presented here.

ファセットとファセットの形状異方性のコロイド カドミウム カルコゲナイド系ナノ構造のリンク

Here, we describe a protocol that allows for shape-anisotropic cadmium chalcogenide nanocrystals (NCs), such as nanorods (NRs) and tetrapods (TPs), to be ...

Chemical Synthesis of Porous Barium Titanate Thin Film and Thermal Stabilization of Ferroelectric Phase by Porosity-Induced Strain

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its well-balanced ferroelectricity, piezoelectricity, and dielectric constant. In addition, BT does not contain any toxic elements. Therefore, it is considered to be an eco-friendly material, which has attracted considerable interest as a replacement for lead zirconate titanate (PZT). However, bulk BT loses its ferroelectricity at approximately 130 &#176;C, thus, it cannot be used at high temperatures. Because of the growing demand for high-temperature ferroelectric materials, it is important to enhance the thermal stability of ferroelectricity in BT. In previous studies, strain originating from the lattice mismatch at hetero-interfaces has been used. However, the sample preparation in this approach requires complicated and expensive physical processes, which are undesirable for practical applications.
In this study, we propose a chemical synthesis of a porous material as an alternative means of introducing strain. We synthesized a porous BT thin film using a surfactant-assisted sol-gel method, in which self-assembled amphipathic surfactant micelles were used as an organic template. Through a series of studies, we clarified that the introduction of pores had a similar effect on distorting the BT crystal lattice, to that of a hetero-interface, leading to the enhancement and stabilization of ferroelectricity. Owing to its simplicity and cost effectiveness, this fabrication process has considerable advantages over conventional methods.

Here, we present a protocol for the synthesis of porous barium titanate (BaTiO3) thin film by a surfactant-assisted sol-gel method, in which self-assembled amphipathic surfactant micelles are used as an organic template.

化学合成チタン酸バリウム多孔質セラミックス薄膜の気孔率誘起歪による強誘電相の熱安定化

Barium titanate (BaTiO3, hereafter BT) is an established ferroelectric material first discovered in the 1940s and still widely used because of its ...

Exfoliation and Analysis of Large-area, Air-Sensitive Two-Dimensional Materials

We describe methods for producing and analyzing large, thin flakes of air-sensitive two-dimensional materials. Thin flakes of layered or van der Waals crystals are produced using mechanical exfoliation, in which layers are peeled off a bulk crystal using adhesive tape. This method produces high-quality flakes, but they are often small and can be hard to find, particularly for materials with relatively high cleavage energies such as black phosphorus. By heating the substrate and the tape, two-dimensional material adhesion to the substrate is promoted, and the flake yield can be increased by up to a factor of ten. After exfoliation, it is necessary to image or otherwise analyze these flakes but some two-dimensional materials are sensitive to oxygen or water and will degrade when exposed air. We have designed and tested a hermetic transfer cell to temporarily maintain the inert environment of a glovebox so that air-sensitive flakes can be imaged and analyzed with minimal degradation. The compact design of the transfer cell is such that optical analysis of sensitive materials can be performed outside of a glovebox without specialized equipment or modifications to existing equipment.

A method for exfoliating large thin flakes of air sensitive two-dimensional materials and safely transporting them for analysis outside of a glovebox is presented.

剥離と大面積解析空気敏感な二次元材料

We describe methods for producing and analyzing large, thin flakes of air-sensitive two-dimensional materials. Thin flakes of layered or van der Waals ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...