我々は、図1で使用されるグラフィックスを提供するためFortéBioに感謝します。この作品は、TMDにNIHの助成金GM083088によってサポートされていました

<html> 1。 BLIアッセイのための測定器のプログラミングランプがウォームアップしますので、事前に測定器を少なくとも1時間の電源をオンにし、これは、ノイズを最小限に抑え、実験中に、光信号のドリフトすることが必要である。サンプルプレートホルダーを予熱し、器具のタブを経由して所望の温度を設定します。そして、データ収集ソフトウェアで実験計画を設定します。実験ウィザード]タブにある「新しい動力学実験」を選択します。これは定義されている必要があり、すべての手順でタブ付きのメニューを提示します。 1.1。プレートの定義 96ウェルサンプルプレート上で使用される列を定義する。バッファ、固定化タンパク質または結合パートナーを含むように列を割り当てます。よく各協会のために、使用される結合パートナーの濃度を入力します。注： 図2に示されているプレートの定義が明確なアッセイのためのオプションがあります。 1.2。検定の定義ontent &quot;&gt;アッセイに必要なすべてのステップを定義します。これらは、（i）ベースライン（数）、（II）読み込み、（III）協会と結合パートナー（IV）の解離が含まれています。その後、後述するように、個々のアッセイ工程をリンクその後、アッセイ段階と、それぞれの列をダブルクリックを選択して、サンプルプレート上のウェルの列。このプログラムは、アッセイ中に次のウェルの1つの列から移動するセンサー。 <ol><li> ベースライン 96ウェルプレート中で、最初のBLIシグナルを確立するために、アッセイ緩衝液中のセンサ（ 図2、列1）を用いて、短い基線工程（≥60秒）で始まる。 </li><li> （センサー上のビオチン化タンパク質を固定化する） ロード ビオチン化タンパク質（ 図2、列2）が含まれていますウェルにセンサーを割り当てます。 （概要を参照）の結合の所定のレベルを達成するために、しきい値関数を使用します。すべてのセンサーは、移動になるように、しきい値オプションを設定センサのいずれかが閾値に達したウェルの次の列にdを。 </li><li> ベースライン センサーから離れて非固定化タンパク質を洗浄し、新しい、安定したベースライン信号を確立するために、バッファ内の別のベースラインのステップ（通常は&gt; 5分、図2、列3）を挙げることができる。のみ（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、会合工程前にバッファの新しいウェル内のセンサー（ 図2、列4）で余分なベースラインステップ（60秒）が含まれています。 </li><li> （固定化タンパク質への結合相手の） 協会 （ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、異なるセンサ/ウェル（ 図2、カラム5）に使用される結合パートナーの濃度範囲を選択する。結合パートナーの少なくとも飽和濃度が信号を結合平衡に近づく必要がありますように、ステップ時間を調整します。のために（ 図5のように）タンパク質-タンパク質複合体の解離の小さなリガンドのアロステリック効果を試験するためのアッセイは、すべてのアソシエーションウェルにおける使用のための結合パートナー（〜10倍推定K Dを超える）単一の高濃度を選択する。 </li><li> （結合相手の） 解離 のみ（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、第4欄（ 図2）、アソシエーションの前に余分なベースラインのために用いたのと同じ緩衝液をウェルに戻すためのセンサを指定する。小さ ​​なリガンドのアロステリック効果を試験するためのアッセイのために、代わりに列6だけでなく、それぞれがバッファプラス異なるアロステリックリガンドを含むことができます（ 図2）に移動するようにセンサーを指定します。 </li></ol> 1.3。センサ割り当てアッセイのための予備湿潤センサーが含まれますセンサートレイ内の位置を示している。実験はFAIになるので空の位置を同定Lないセンサーがピックアップされていない場合。 1.4。レビュー実験間違いをチェックし、それらを修正する戻って、すべての計画された手順を視覚化する。 1.5。走行実験データファイルの場所など、必要な詳細を入力します。実験のために所望の温度を入力します。センサーは、まだプレウェッティングが必要な場合は、実験開始を遅らせるためのオプションを選択します。最終的には、一度にすべてのサンプル調製は、（ステップ2）が完了し、サンプルプレートとセンサートレイの両方は、機器にロードされ、分析を実行するために[Go]ボタンをクリックします。 2。試料調製<ol><li>適切なアッセイ緩​​衝液を準備します。 （pHを8.0に調整するために添加） - （（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸3）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ-メタン）、50mMのKCl、20mMのMOPS：バッファは、 図3および図5に示す実験に使用した。 BSA（ウシ血清アルブミン、遊離脂肪酸、0.5を含むすべてのアッセイ工程のためのビオチン化タンパク質または結合パートナーのすべての希釈は、センサーへのタンパク質の非特異的な結合を最小限にするためのバッファでの）mg / mlの最終的な。 </li><li> （概要を参照）適切な濃度にアッセイ緩​​衝液中でビオチン化タンパク質（ε）を希釈します。 </li><li>アッセイ緩衝液中の結合パートナー（F 1（-ε））（、使用する濃度の範囲のための議論を参照のこと）の希釈液を準備します。 </li><li>それらの保護スクロースコーティングを除去するために、少なくとも10分間、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサーを予め湿ら。センサートレイからセンサ内蔵ラックを取り外し、トレイの底に96ウェルプレートを挿入し、トレイ上の配向ノッチにプレートの一角をスライドさせる。センサの列が使用されるためには、96ウェルプレートのカラムにウェルあたりのアッセイ緩​​衝液200μlを加える。 （スロットのタブ付き）正しい方向にトレイにセンサーのラックを返します。 </li><li>ステップ1でのプログラミング時に割り当てられたとして、O井戸を埋める図2のようにアッセイ緩衝液又は適当なタンパク質希釈物fのサンプルプレート。彼らは、光信号のノイズの原因となりますので、気泡を導入することは避けてください。 （I）ビオチン化タンパク質または（ii）結合パートナーのいずれかを省略した1以上の基準井戸があります。 </li><li>ステージのスロットに挿入され、トレイのタブで、（左）機器のドアを開き、ステージにセンサートレイを挿入します。プレートホルダー（右）にサンプルプレートを挿入し、プレートホルダーに示されるように、プレートは、平らで正しい向きに装着されていることを確認してください。ドアを閉じ、データ収集プログラム（ステップ1.5）からアッセイを開始する。 </li></ol> 3。データ処理<ol><li>分析の実行後、データ解析ソフトウェアを起動し、データを格納しているフォルダをロードします。各センサで、（左の）段階的な処理メニューと生動態データを見るために「処理」タブをクリックします（A〜H）の異なる色が割り当てられます（図3）。 </li><li> 「データの選択」の下に、「センサーの選択」ボタンをクリックしてください。 「サンプルプレートマップ」上で、参考井戸として1または2制御センサ（G、 図3の測定ではH）のための井戸を指定します。 Processingメニューの「引き算」チェックボックスをオンにし、他のすべてのセンサの信号から（シングルまたは平均した）基準信号を減算する「リファレンス·ウェルズ」を選択します。 </li><li> 「整列Y軸」の手順を使用して、Y = 0にすべてのトレースの位置を合わせます。アライメント工程（これは会合工程前の最後のベースラインである）などの「ベースライン」を選択します。 「時間範囲」については、そのベースライン（ 図3のように、60秒のベースラインのすなわち 、50〜60秒）の最後の10秒を入力します。 </li><li>会合および解離のステップとの間の信号シフトを最小限に抑えるために「インターステップ補正」チェックボックスをオンにします。ベースラインまたは解離合わせる]を選択します。 </li><li>ほとんどの場合、サビツキー·ゴーレイフィルタ機能を選択し、クリックして &quot;プロセスデータを！&quot;続行します。視覚的に検査最終処理されたデータ（右下のパネル）。信号トレースは、結合と解離ステップの間には有意な変化を示している場合（ 図4のように）グローバルデータ解析のために意図されたアッセイと、「インターステップ補正」の解離またはベースラインの選択を変更し、データへ進む前に、データを再処理する分析。 </li></ol> 4。データ解析開始するにはデータ解析の「分析」タブをクリックします。注：以下の例の手順は、（ 図3のように）複数の結合/解離曲線のグローバル分析のためのものです。 <ol><li> 「分析するステップ」の場合は、会合および解離を選択します。 「モデル」については、午前1時01分]を選択します。注：その他の制限されたオプションが使用可能です。 </li><li> 「フィッティング」については、（フル）グローバル]を選択します。 」とは、基」の（グラフのように）色を選択します。 （R maxの独立したフィッティングを可能にするために「センサーによってリンクされていないのR マックス 」 を選択してPARの結合を飽和させる時に最大信号応答固定化タンパク質へtner）。注：センサーが固定されたタンパク質の量が多少異なるように、我々は（ 図3、ロードしています）、ほとんどのアッセイのためにこれを行う。 </li><li>示すテーブルに、分析しようとするすべてのセンサーのトレースが同じ色を持っているので、彼らはグローバルセットとして分析されることを確認してください。必要に応じて、1つ以上のセンサーがグローバルフィッティングから省略するためのトレースを選択します。「含む」列の下に、所望のセンサの位置を右クリックし、「ウェルズの除外」を選択します。 </li><li> 「フィットカーブを！」をクリック非線形回帰分析を開始します。 、決定されたパラメータ値（速度定数、R マックスでは、（i）（ 図4のように）センサデータのトレースで回帰曲線を重ね、フィッティング残差の（II）のプロット、及び（iii）表が含まフィッティング結果を調べるK D）と統計パラメータについて（標準誤差、カイ二乗、R 2）。 </li><li> 「データのエクスポート」の下で、「CSVファイルへのエクスポート表」をクリックして、フィッティング結果を保存します。 grapを用興または他のソフトウェアとのデータ/装着曲線の更なる分析は、テキストフ​​ァイル内の各センサーのデータと近似曲線を保存する「エクスポートフィッティング結果」をクリックしてください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. 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L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

著者らは、利害の衝突を持っていないことを宣言します。

BLIのための現在利用​​可能な機器は、生体分子の相互作用のためのアッセイにおいて有意なスループットと柔軟性を可能にします。種々の溶液試料は黒色マイクロタイタープレートのウェルに分配され、平行BLIセンサのセットは、プレート上のウェルの列の間を前後に移動するようにプログラムされる。サンプルは、アッセイを通じて軌道振とうにより撹拌する。ここで使用されるシステ...

タンパク質-タンパク質相互作用は、多くの生物学的プロセスのために重要であり、表面プラズモン共鳴（SPR）のようなラベルフリー光学的方法1の結合及び解離の動態を研究するためにインビトロで使用されてきた。ほとんどのラベルフリーの方法は、センサ表面上の1生体分子を固定化し、それが固定化された生体分子1と会合するように溶液から結合パートナーを検出するための光信号を使用しています。 SPRは、高感度な方法であるが、それは、センサ2の上を流れる溶液の屈折率の変化による干渉を受けやすい。 SPRほど敏感ではないが、バイオレイヤー干渉法（BLI）が少ないサンプル組成1,3の変化に影響される。 BLIは、先端に独自の生体適合性コーティングを有する光ファイババイオセンサーを使用しています。 （オクテットRED96）ここで使用されるシステムは、8つの分光光度計が含まれています。白色光は、ロボットアームに移動したプローブの行にパイプされる。光ファイバセンサのアルeは、プローブによってピックアップされたサンプルを含む96ウェルプレートに移動した。標的分子の一つは、バイオセンサー表面上に固定化される。次いで、センサは、溶液中の結合パートナーを含むウェルに移動される。 BLIは固定化された分子と結合パートナーとの会合を監視してから、結合相手なしでソリューションにセンサーを移動した後に解離を監視します。バイオセンサー表面への分子の結合は、内面からとセンサと溶液との間の外部インタフェースからの分光光度計に戻って反映させる光波の間の光の干渉の変化につながる。干渉におけるこれらの変化を定量化し、 図1のアニメーションにまとめたように、結合および解離の速度論的速度を決定するために用いることができる。 私たちは、酵素を自動阻害することができる細菌のATP合成酵素とそのεサブユニットの触媒複合体の間の相互作用を測定するために、BLIを適用している。 ATP SYnthaseは、ATP 4の合成と加水分解を触媒膜に埋め込 ​​まれた回転ナノモーターである。触媒複合体（F 1）は、ATPアーゼとして機能する可溶性の形で単離することができる。サブユニットεは二つのドメインを持っている：N末端ドメイン（NTD）は適切な組み立てと、酵素の機能的結合のために必要であるが、触媒サブユニットと直接相互作用しない。C末端ドメイン（CTD）がと相互作用することによって酵素を阻害することができる複数の触媒サブユニット5,6。このε媒介規制は細菌のATP合成酵素に特有のものであり、ミトコンドリアの相同体で観察されていません。薬剤耐性結核7を治療するbedaquilineの最近のFDAの承認で示すように、ATP合成酵素は、抗菌薬のターゲットとして浮上している。これにより、創薬のためのεの阻害的役割を標的とすることは、ミトコンドリアATP合成酵素を阻害しない抗菌剤を得ることができる。孤立した触媒錯体（F 1）、εと解離性サブユニットになる。しかし、F 1に結合しているεで、εCTDは部分的に酵素の中央空洞内に挿入し、直接6,8解離性は低い抑制状態を形成し、劇的な構造変化を受けることができる。我々は、触媒サイトがεのコンフォメーション上のリガンドのアロステリック効果を調べるために、間接的にFが1 /ε結合と解離の反応速度を測定し、するBLIを使用しています。 （SPR等）BLI信号が表面に結合する分子の質量に敏感であるので、我々のシステムにおいては、εは、センサ表面に固定化するために選択した。 εサブユニットは、メインF 1複合体（〜347 kDa）の、小さな（〜15 kDa）の相対的です。このように、より大きなBLI信号が固定化されたεに、F 1の結合からなります。非常に遅くなることが、F 1解離を、監視するために、εは強く固定化されている必要があります。したがって、私たちは、ビオチン化することにしました、およびストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー上に固定。タンパク質は、表面リジン9の（I）のランダム変更、ビオチン-マレイミド試薬10または（iii）遺伝的に酵素的に中にビオチン化され、特定のビオチンアクセプターペプチドを付加した独自のネイティブまたはシステイン（II）の反応により、ビオチン化することができるタグ付けされた蛋白質11のin vivo発現における 。我々のシステムでは、εは法（III）8を使用してビオチン化する。ビオチンタグ化εストレプトアビジンセンサー上に固定化されると、BLI結合およびサブユニットε（F 1（-ε））を枯渇されたF 1の解離を測定することができる。ここに記載の実験のために、予備的アッセイは、センサー上に固定化するためにビオチン化タンパク質の合理的な量を決定することは行われていた。これは、タンパク質の分子量およびその結合パートナーに応じて、変えることができるが、目標は、固定化タンパク質tの最小量を決定することである帽子は、（i）許容信号対雑音（K D下）結合パートナーの濃度が低いと結合パートナーのほぼ飽和濃度との結合動態（II）の最小限の歪みで反応速度を結合するために用意されています。また、ビオチンの化学量論は一貫BLI信号は、ストレプトアビジン被覆上に固定化の間に達成することができることを確認するために変化する（ただし、&gt; 1モルビオチン/モルタンパク質を避ける）ため、いくつかの初期のアッセイは、ビオチン化タンパク質のそれぞれ新しいロットのために必要とされてもよいセンサー。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

我々は、 大腸菌の ATP合成酵素の触媒複合体とサブユニットεの阻害相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法の使用を記載している。細菌のF型ATP合成酵素 薬剤耐性結核と闘うための新しい、FDA承認の抗生物質のターゲットである。サブユニットεのC末端ドメインによりATP合成酵素の細菌特有の自己阻害を理解することは、抗菌薬の発見のための酵素を標的とする新しい手段を提供することができます。 εのC末端ドメインは、アクティブ状態と非アクティブ状態、および触媒部位リガンドとの間の酵素の遷移が支配的であるεのコンフォメーションのどの影響を与えることができる劇的な構造変化を起こす。 εの結合/触媒複合体の解離、および間接的にMEAのアッセイは、動態sures明らかnondissociable阻害コンフォメーションとの間での酵素結合εのシフト。バイオレイヤー干渉信号は、溶液組成物に過度に敏感ではないので、それはまた、εのコンフォメーション変化に触媒部位リガンドのアロステリック効果をモニターするために使用することができる。

リアルタイム結合および解離動態BLIを図3に示す。この実験は、会合および解離アッセイ緩​​衝液で行った。センサーは短時間だけを予め湿らされていたので、この実験は、10分のベースラインのステップを開始した。次に、ビオチン化εは、センサにロードした。 εの検出可能な解離は結合パートナーが追加されていなかった基準曲線（G）から見て、残りのすべての工程を通?...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 - タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法を適応している。

タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.7K ビュー.  SUNY Upstate Medical University. ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 - タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレ?...

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

化学

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

コロイドプローブナノスを使用して、粒子間相互作用の定量的および定性的調査

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

ELISAベースの結合と競争法は急速にリガンド - 受容体相互作用を決定するために、

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

硫黄コポリマーマトリックス内リガンドフリーのCdSナノ粒子の合成

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

ビスiminoguanidiniumリガンドと選択的結晶化により硫酸の分離

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

貴重なリガンドにアクセスすると、遷移金属のためのサポート：1,2,3,4,5-ペンタメチルシクロペンタジエンの変形、中間規模の調製

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

リガンドを介した核生成とパラジウムの金属ナノ粒子の成長

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.