このプロジェクトは、（AJBとLGAのため、R01 AI076246）健康NIAIDの国立研究所のための助成金によって部分的にサポートされていました。 サルモネラ変異体のコレクションの一部は、HAP、R21のために（部分的に健康補助金の国立研究所によって、（MM、U01 A152237-05、R01 AI07397-01、R01 AI039557-11およびR01 AI075093-01用）健康補助金の国立研究所によってサポートされていましたAI083964-01、1R0 1AI083646-01、1R56AI077645、R01 AI075093）。私たちは、レプリカ平板法とコレクション内の変異体を確認するためのシュテフェンProwollikに感謝します。

1マウスマクロファージRAW264.7細胞培養<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中でT-75細胞培養フラスコ通気フィルタキャップに低い継代数マウスマクロファージ細胞を増殖、RAW264.7（ATCC®番号、TIB-71） 5％CO 2インキュベーター中、37℃で0.5％のNaHCO 3、および1％100×非必須アミノ酸（NEAA）。 </li><li>細胞がフラスコ中の60〜80％コンフルエンスに達したら、細胞を採取し、血球計で細胞を計数し、細胞濃度を計算するために、細胞スクレーパーを使用する。 </li><li>細胞を再懸濁し、新鮮なDMEM細胞培養培地中で2.5×10 5 / mlの細胞濃度に希釈する。 96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに5×10 4細胞を含有するDMEM細胞培養培地200μlをプレートにマルチチャンネルピ ​​ペットを使用する。 </li><li>各サルモネラ株の 4つのウェルをプレート。 1セットのために3つの個別のプレートをセットアップします食細胞浸潤アッセイの、それぞれ、「会合」、「侵略」と「複製」でそれらをマークします。 </li><li>マクロファージ細胞をウェルの底に付着させ、37℃ON、5％CO 2インキュベーター内でプレートを置きます。 </li></ol> サルモネラ野生型および変異体の作製<ol><li>マクロファージRAW264.7細胞を調製する同じ日に、野生型（WT） サルモネラ菌血清型ネズミチフス菌の14028s、DinvA変異体、DphoP変異体、および所望の試験変異株、およびルリア-ベルターニ（文化、それらを単一のコロニーを選択必要に応じて抗生物質を添加したLB）培養液。 10変異株（DinvA変異体とDphoP突然変異体は、それぞれ、浸潤および細胞内複製に欠陥がある）までテストするために食細胞浸潤アッセイの各セットを使用してください。 </li><li>秒、37℃で14時間、細菌を育てる丸底チューブにゆるく蓋をし14ミリリットルポリプロピレンで5ミリリットルのLBブロスのそれぞれにおいて220 rpmでhaking。 LBブロスは、50μg/ mlの、私たちの場合には、変異株のほとんどが、カナマイシンに耐性を示す、適切な抗生物質が含まれています</li><li>次の日、220 rpmで振盪しながらさらに4時間、1:50の比率でのLBブロスの平野5ml中のサルモネラ菌株の培養物に対するサブカルチャーをそれぞれ。 </li><li> ODを分光光度計で、各細菌培養の600の値を読み、それぞれの読み取りはサルモネラ病原性島-1 III型分泌系（SPI-1 TTSS）侵略のための遺伝子発現を最適化するために、0.6から1.2の範囲であるべきである。 </li><li>新鮮なDMEM細胞培養培地中のmlの5×10 6 CFU /の濃度に菌を希釈、その後、細菌濃度を推定するために1 OD 600 = 7.5×10 8 CFU / mLの計算式を使用してください。 </li></ol> 96ウェル培養プレート中で3浸潤アッセイ<ol><li> 3 96ウェルセル画を削除するCO 2インキュベータからL培養プレートおよび1×PBS緩衝液200μlで一回各ウェルを洗浄する。 </li><li>洗浄およびPBSを完全に除去した後、各ウェルに200μlの細菌DMEM培地（上記参照）を追加する。 1：これは20の感染の各ウェルと多重度が1×10 6 サルモネラ細胞 （MOI）になる。 </li><li> 10分間の密閉されたキャリアは1,000×gで遠心分離し、プレートを、その後、37℃、30分間、5％CO 2インキュベーターでプレート（時間ゼロ）を交換してください。各株については、少なくとも4つの連のウェルを設定します。 </li><li> 30分後、インキュベーターからプレートを取り外して、関連付けられていない細菌を除去するために1×PBS200μlで3回洗浄。 </li><li>洗浄後、更なる処理のための「会合」で標識されたプレートを保存します。オーダーT内の「侵略」と「複製」でマークされたプレートの各ウェルに100μg/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地200μlを追加O。外サルモネラ菌を殺す追加の時間、37℃、5％CO 2インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>マクロファージ細胞数を記録するための各感染株から1つのウェルに保存する、10分間、1％トリトンX-100を含有する1×PBS200μlで「会合」プレート上のウェルの残りの部分を扱う。トリトン溶液は、マクロファージ細胞を溶解し、関連したサルモネラをリリースします。 </li><li>各ウェルから収穫サルモネラおよび1.5mlのエッペンドルフチューブに入れます。各ウェルから採取したサンプルに900μL1×PBSで3 10倍連続希釈を行い、渦は、各希釈の間で実行される。 </li><li>どちらLB（WT）またはLB館（突然変異体）プレート上に第3の希釈、10 -3を 、プレート。適切なサルモネラ株名、希釈番号、時刻と日付のプレートにラベルを付けます。 </li><li>第三の希釈チューブをボルテックスした後、寒天の表面に10μlのサンプルを分注するとfを繰り返します5滴の合計のための私達の回。 510μlをペトリ皿プレート7上に均一に落下空間にいることを確認してください。 </li><li>滴が寒天に浸透した後、上の板を回し、37℃、5％CO 2インキュベーターで一晩インキュベートする。 </li><li> 10分間、0.25％トリプシン-EDTAを含む150μlのを1×PBSとマクロファージの計数のために保存された井戸を扱います。 </li><li>トリプシン処理後、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに場所マクロファージとは、トリプシン/ EDTA溶液を中和するために、FBS50μlとそれらを扱う0.4％トリパンブルーを用いて細胞を染色し、血球計を使用してを介してそれらをスコア。 </li><li> 1時間のインキュベーションが経過すると、CO 2インキュベータからの「侵略」と「複製」のプレートを取り外してから、「ステップ3.4」として、各ウェルを洗浄する。 </li><li> 「ステップ3.6から3.12」として更なる処理のための「侵略」のプレートを保存します。 </li><li>に10μg/ mlのゲンタマイシンを含むDMEM培地200μlを追加します。培地中で細胞外サルモネラのクリアランスを維持するための「複製」のプレート。 37℃、追加の22.5時間、5％CO 2のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li>次の日、37℃、5％CO 2インキュベータから「複製」のプレートを取り外して、「ステップ3.4」として、各ウェルを洗い、「ステップ3.6から3.12」として扱う。 </li><li>最後に、37℃のインキュベーター中で一晩インキュベートした後、寒天プレートを除去し、細菌コロニーの数をスコア。 </li><li>良いコロニー分布は10〜100個のコロニーの間でなければなりません、各スポットは、約2から20個のコロニーが含まれている一つの場所に20以上のコロニーがあった場合、それが得点するのは難しいだろう。カウントが低すぎたり高すぎると、必要に応じて10倍高いまたは低い希釈でサンプルをreplate。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>メッキに基づいて、各プレートのCFU（1ml当たりのコロニー形成単位）を計算するボリュームと希釈係数。 </li><li>各株から記録されたマクロファージ細胞数を通してマクロファージあたりのサルモネラの数を確認。 </li><li>それぞれ、細胞結合、浸潤または複製のための少なくとも3つの独立した実験からのマクロファージあたりのCFUの幾何平均を計算し、相対値をWTにさらに正規化する。 </li><li> WTの各菌株を比較することで、それぞれのスチューデントのt -testによる関連、浸潤、およびレプリケーションのためのデータを分析し、p値による統計的有意性を決定する。 </li></ol>

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	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. 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J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

ゲンタマイシン保護アッセイが広く、宿主細胞内の細胞内細菌性病原体の侵入および複製を研究するために使用され、それは、特に、その侵入感染1を確立するための前提条件のステップであるサルモネラのように、病原体を研究するための重要な生物学的ツールである。 サルモネラ研究コミュニティにおける標準ゲンタマイシン保護アッセイを24ウェル培養皿<sup...

非チフス性サルモネラは、すべての脊椎動物の腸内疾患の重要な原因である。ヒトでのサルモネラ症は、トップ細菌性食品媒介疾患1つである。彼らの動物宿主でサルモネラとの相互作用を支える分子機構の特性は、主に、感染の組織培養および動物モデルでのサルモネラ菌血清型ネズミチフス菌（STM）の研究によって達成される。 STM-ホスト相互作用に洞察を得ることは、私たちはサルモネラ菌が生存し、宿主細胞の内部成長をどのように理解するのに役立ちます。これらの相互作用を研究する最初の課題は、ホストと病原体の両方から可能な限り多くの参加要因を特定することであるが、これらの努力は、主に、同時に2つの独立した複雑な生物学的システムを扱う、 すなわち 、ホストとサルモネラの重要な難しさによって妨げている 生理的条件下で。さらに、大規模なrepertサルモネラのoire、潜在的にホストの相互作用に関与する因子をコードする宿主遺伝子は、この課題に取り組むために、ハイスループットの生物学的なプラットフォームを必要とします。 サルモネラの関連付けを表現型に変更され、標準化されたアッセイは、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける侵略と複製が可能性が高いサルモネラ -host相互作用に従事した遺伝子の大規模なセットを調べるために開発されました。ゲンタマイシン保護アッセイは、1973年2で開発されましたが、最初に徹底的に1994年3,4にElsinghorstによって記述されていた。今では、サルモネラ 5,6を含むex vivoで多くの細胞内細菌性病原体を、研究するための標準的なツールとなっています。内部化細菌は真核細胞3に浸透することはできませんゲンタマイシンのようないくつかの抗生物質、によって殺されることを避ける。この現象を利​​用することによって、ゲンタマイシン保護アッセイは、細胞内のBAの生存および増殖を測定するcterial病原体。感染の間の3つのイベント、 すなわち 、真核細胞浸潤及び複製との関連、感染症、ゲンタマイシン処理、およびさらなるインキュベーション（ 図1）との間の時間間隔に基づいて、細胞内細菌性病原体について評価することができる。真核細胞系は、宿主 - 病原体相互作用の研究のための適切な動物モデルよりも複雑で、生理的環境を提供する。 ゲンタマイシン保護アッセイは、STM-宿主の相互作用を研究するための適切なプラットフォームであるが、24ウェル培養皿中の標準アッセイは、ロースループット容量を有する。 インビボでのデータセットのコンピューター分析は、約300宿主遺伝子産物（未発表データ）と相互作用することが予測される149 サルモネラ遺伝子産物を同定した。標準ゲンタマイシン保護アッセイを効率的に突然変異体のこの数を表現型に能力を持っていません。 ADDITでイオン、ゲンタマイシン保護アッセイは、理論的には単一の細菌の侵入を検出することができる。異なる時間に繰り返されるときこのため、固有の感度で、生データは、技術的差異の影響を受けやすい。内部統制および正規化後の相対的なデータの提示は、結果の意味の解釈のために不可欠である。これらの考察を考慮すると、修正された、標準化されたゲンタマイシン保護アッセイは、試験能力を向上させ、精度を高めるために開発された。 以下のプロトコルを詳細かつ96ウェル培養皿及びマウスマクロファージRAW264.7細胞株を使用して変更ゲンタマイシン保護アッセイを行うことが示されている。 24ウェル培養皿中の標準プロトコルと比較して、修正されたプロトコルは、以下の利点を有する：1）96ウェル培養皿を使用すると、十分な統計的検出力を有する内部陽性対照および陰性対照を含む表現型を決定するために10の異なる変異株まで使用でき;変異体株は、同一の培養皿に、同時に試験するため、2）結果の分散が大幅に低減される。オペレータの疲労を軽減しながら3）マルチチャンネルピペットの使用は、スループットを増加させる。最後に、24ウェル培養皿に比較して、96ウェル培養皿中でウェルあたり少ない宿主細胞の懸念は、プロトコルの最適化および標準化することで解決した。 要約すると、食細胞におけるインビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、侵入および複製に変更された、標準化されたアッセイは、精度が向上し、オペレータの疲労を低減しつつ、高スループット能力を達成する。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Cell culture flask vented filter cap</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>96-well Cell culture plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin solution</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

サルモネラ種は、人畜共通の病原体とヒトや家畜1における食品媒介性疾患の主要な原因である。 サルモネラ -host相互作用のメカニズムを理解することは、 サルモネラ感染症の分子病態を解明するために重要である。食細胞におけるサルモネラ関連付けを表現型にゲンタマイシン保護アッセイ、浸潤及び複製は、RAW264.7マウスマクロファージを用いて宿主相互作用におけるサルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌の欠失変異体の役割を定義するためのハイスループットスクリーニングを可能にするように適合させた。このプロトコルの下で、分散野生型および複数の変異株が同一の培養皿に、同時に試験することができるので、測定値に有意に、標準プロトコルと比較して低減される。マルチチャンネルピペットの使用は、スループットが向上し、精度を向上させる。さらに、懸念が少ない鎬使用に関連96ウェル培養皿中でウェルあたり番目の細胞が対処された。ここでは、食細胞を使用して修正インビトロサルモネラ浸潤アッセイのプロトコールに成功協会、浸潤および細胞内複製のための38の個別サルモネラ欠失変異体を表現型に採用された。 インビトロ表現型は、そのうちのいくつかは、その後、動物モデルにおいてin vivo表現型を持っていることが確認された、提示される。このように、ハイスループット能力を有するマクロファージにおける修正された、 サルモネラの関連付けを表現型に標準化されたアッセイ、浸潤および複製は細菌-宿主の相互作用を研究するために、より広く利用することができる。

データが変更された食細胞浸潤アッセイに基づいてプロットされた後、代表的な結果（ 図2）を参照してください。データは複製8欠陥があることが知られている5の異なる株、WT、ΔinvA、ΔphoP、変異体A、および侵入のための欠陥があることが知られている突然変異体B.ΔINVA、およびΔphoPを含む、実験的な妥当性を評価するための陽性対照として使用され...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.6K ビュー.  Texas A&M University.  インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。 

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Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面<em&gt;トキソプラズマ</emIFN-γ依存性細胞自律イミュニティへの抵抗のための重要な&gt;遺伝子

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

免疫・感染学

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of various cytokines and chemokines. NF-&#954;B is constitutively expressed and is sequestered in the cytosol by the inhibitory protein nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor, alpha (I&#954;B&#945;). Activation of NF-&#954;B requires the degradation of I&#954;B&#945;, which then exposes a nuclear localization signal on NF-&#954;B and promotes its trafficking to the nucleus. Once in the nucleus, NF-&#954;B binds to the promotor region of NF-&#954;B target genes such as interleukin 6 (IL-6) and IL-23, to promote their expression.
The activation of NF-&#954;B occurs independently of transcription or translation. Therefore, the activation state of NF-&#954;B must be measured either by quantifying NF-&#954;B specifically in the nucleus, or by quantifying expression of NF-&#954;B target genes. In this protocol, cells stably transfected with an NF-&#954;B::luciferase reporter construct are assayed for NF-&#954;B activation using in vitro tissue culture techniques. These cells are infected with Salmonella Typhimurium to activate NF-&#954;B, which traffics to the nucleus and binds to &#954;B sites in the promoter region of luciferase, inducing its expression. Cells are lysed and analyzed with the luciferase assay system. The amount of luciferase produced by the cells correlates with the intensity of the luminescence signal, which is detected by a plate reader. The luminescence signal generated by this procedure provides a quick and highly sensitive method by which to assess NF-&#954;B activation under a range of conditions. This protocol also utilizes quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to detect relative mRNA levels that are indicative of gene expression.

Here, we present a protocol to quickly and easily measure nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-&#954;B) activation in cell lines expressing NF-&#954;B::luciferase reporter constructs, via measurements of luminescence in the cell lysate. Additionally, gene expression is determined via RT-qPCR isolated from cells infected with Salmonella Typhimurium.

サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Source: Sarkar, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the macrophage and parasite nuclei.

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

1. Plating BMMs on Coverslips for Infection 

	Prepare 6-well tissue culture plates by placing four (4) sterile 12 mm glass coverslips (autoclaved and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

An Assay to Quantify Cytosolic and Vacuolar Salmonella in Infected Primary Macrophages

Source: Meunier, E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52960">Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to quantify cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium inside bone marrow-derived macrophages using differential permeabilization. The macrophages are infected with a fluorescent protein-expressing Salmonella, which is internalized inside a specialized vacuolar structure called Salmonella-containing vacuole or SCV. A subset of bacteria escape the SCV and enter the cytosol. The cholesterol-rich plasma membrane of macrophages is permeabilized using digitonin, leaving the SCV intact. Upon labeling the cytosolic bacteria with a fluorescently tagged antibody, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria is quantified using fluorescence-activated cell sorting (FACS).

表現型のハイスループットアッセイ

要約

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この動画の章

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面

液胞対細胞質の定量化

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

ImageJを用いたサルモネラ菌の細胞内表現型自動解析

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

感染した初代マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌の定量化アッセイ

表現型のハイスループットアッセイ

要約

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液胞対細胞質の定量化

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

感染した初代マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌の定量化アッセイ

ImageJを用いたサルモネラ菌の細胞内表現型自動解析