Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

10nmの金ナノ粒子（ゴールドNPS）15の1の合成<ol><li>溶液Aを準備します160ミリリットルミリQ、または再蒸留水に2ミリリットル1％水溶液塩化金を追加します。 </li><li>溶液Bを準備します32ミリリットルミリQ、または再蒸留水に8ミリリットル、1％のトリクエン酸ナトリウム×2、H 2 Oおよび160μlの1％タンニン酸を追加します。 </li><li> 60℃に溶液A及びBをウォームアップし、攪拌しながら、それらを混合する。すぐに濃い青色を観察します。約15分後に赤色を観察します。その後、95℃まで加熱し5分間保持し、RTに溶液を冷却する。 </li><li>カーボンコーティングされたグリッド上にNP懸濁液のドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡によってNPの大きさや形態を確認してください。 </li></ol>ローダミンN-ヒドロキシエステル（NHS）とBSAとラベリングゴールドNPの2コーティング16 <ol><li> 、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに900μlの30分間15000×gで遠心機を金NPSを追加します。オペアンプtionally月一度に複数のチューブを準備します。 </li><li> 、900μlのペレットに滅菌ミリQ水を再懸濁し、100μlの2mg / mlのBSA / PBSを追加し、上清を捨て、30分間、800rpmでボルテックスに混ぜる。 </li><li>過剰のBSAを除去するために、60分間15000×gで準備を遠心する。 </li><li>上清を捨て、そして125μlのPBS中の金-BSA NPSを再サスペンド、1M重炭酸塩の12.5μlを添加する。 </li><li>使用直前に、金-BSA NPの懸濁液1ミリリットルするローダミンNHS / DMSO溶液30μlを添加、ローダミンNHS / DMSOの10 mg / mlの溶液を調製。光への暴露を避け、800rpmで混合中に室温で2時間（またはO / N）のための反応をインキュベートします。 </li><li> 48時間 - 36の期間にわたって5バッファ変更で4ºCでPBSに対して透析41612-BSA-ローダミンNPSを精製する。 </li><li> NPSを安定させるために、各1ミリリットル金-BSA-ローダミンのNPに200 mg / mlのBSA / PBSの10μlを添加する。 15で、無料またはBSA-ローダミンリリース遠心分離機を削除するには、60分間、000×gで。光への暴露を避け、4℃でOD 520、およびストアを測定する、2 mg / mlのBSA / PBSにペレットを再懸濁する。 </li><li> 、ミリQまたは二重蒸留水でNPを10倍に希釈炭素被覆グリッド上にドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡（TEM）によるNPのサイズ及び形態を確認する。 NOTE：NPの調製のために使用されるすべての材料は、滅菌した操作は、細胞培養フード内または火炎横ベンチを行った。 </li></ol>ヒーラ細胞の3文化<ol><li>永久LAMP1-GFPを発現するHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むDMEM中で培養し、5％CO 2を含む雰囲気中で37℃で増殖させている。 </li><li> 8ウェルチャンバースライド（Ibidi）においても50,000の密度で細胞を播種し、O / Nインキュベートする。 </li></ol>細菌の4。文化<ol><li>使用サルモネラ·エンテリカ血清型TyphimuriumのNCTC 12023ウィルd軸型（WT）株。比較のために、SIFのキーエフェクターSIFAを欠いSPI2-T3SSとΔSIFAにおける欠損変異株のΔssaVを使用しています。強化されたGFPの構成的発現のためのプラスミドpFPV25.1を保有する菌株を使用してください。 注：細菌株は、50μg/ mlのカルベニシリンおよび/ ​​または50μg/ mlのカナマイシン（ΔssaV、ΔSIFAを追加してルリア-ベルターニの50μg/ mlのカルベニシリン（WT）を添加した培養液（LB）とLB中で日常的に培養され、 ）プラスミドを維持するために必要である。 </li><li>適切な抗生物質で3ミリリットルのLB中の細菌の単一コロニーを接種し、新鮮なLBで1：31に希釈し、3.5時間のために成長を続ける、その後、通気のための条件をとうしながら37ºCでO / Nを育てる。この時点で、培養物を後期対数期に達し、細菌は非常に侵襲的である。 「ローラードラムは「通気試験管培養物をインキュベートするのが便利である。 </li></ol>によるHeLa細胞の感染5。サルモネラとゴールド-BSA-ローダミンNPは、チェース·ラベリングパルス（スキームについては図1を参照） <ol><li>継代培養した細菌のOD 600を測定し、OD 600に希釈= 0.2mlの1 PBS（〜3×10 8 cfu / mlで）、多数のを達成するために、8ウェルチャンバースライド中のHeLa細胞への細菌の適切な量を追加100の感染（MOI）。 </li><li> （この時点を0時間感染後、0時間のπとした）の非内在化細菌を除去するためにPBSで3回洗浄し、細胞インキュベーター中で30分間インキュベートする。 100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培養液の300μl添加し、1時間維持する。その後、インキュベーション時間の残りのための10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培地で培地を交換してください。 </li><li> 1時間、100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する培地とのインキュベーション後、培地を同時（30mMのHEPES、pH7.4で、FCS、L-グルタミン、フェノールレッド、および炭酸水素ナトリウムなしイーグルMEM）培地を撮像して置換されている10μg/ mlのゲンタマイシンをntaining。金BSA-ローダミンNPはOD 520 = 0.1の最終濃度を得るために、HeLa細胞に添加される。 NOTE：金BSA-ローダミンNPはまた、感染の前に、または種々の時点のπで細胞に添加してもよい</li><li> 1時間のインキュベーション後、培地を除去し、PBSで3回洗浄し、インキュベーション時間の残りの10％のFCSおよび10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な画像形成媒体の300μlを添加する。 注意：インキュベーションの時間は、使用のNPおよび細胞株の濃度に依存して変化し得る。 RAW264.7マクロファージに関しては、十分な内在許可OD 520 = 0.05の濃度のNPとその30分のインキュベーションを観察した。 </li></ol> 6.イメージング<ol><li>共焦点レーザー走査（CLSM）またはスピニングディスク共焦点イメージングシステムの異なる時点での高分解能イメージングのための加湿環境チャンバーと（SD）顕微鏡を使用する。 </li><li>温度Cに切り替えontrolシステム、それが安定するまで待ちます。そのような倍率、スキャン速度、分解能、ZスタックなどGFPのために適切な励起/発光の設定を使用し、金-BSA-ローダミンNPのような画像の設定を最適化します。このプロトコルのために、512×512ピクセルの400 Hzのスキャン速度、分解能および0.25μmのZ-ステップサイズを使用。それぞれ、Arレーザ（488 nm）をHeNeレーザー（543 nm）を用いて、GFPと金-BSA-ローダミンエキサイト。セルの形状を観察するための明視野（BF）のチャンネルを含める。他の顕微鏡システムおよび感染条件については、設定に応じて調整されなければならない。 NOTE：BFチャネル信号の光源がフォトマルチプライヤ（PMT）検出器で検出されたのと同じArレーザを使用する。 </li><li>指示された時点のPIでは、顕微鏡ステージと記録画像に感染した細胞を含む8ウェルチャンバースライドをマウントします。 </li></ol>画像の7.分析<ol><li>顕微鏡画像解析ソフトウェアを使用して（参照<stronG&gt;材料および装置の表）は、細胞内サルモネラによるエンド-リソソームシステムの再構築を分析する。 「開く」をクリックし、ファイルを選択してデータを開きます。 注：あるいは、このようなImageJのかFIJIなどのオープンソース·ソフトウェア·パッケージは、定量的画像解析に使用することができる。 </li><li>アイコンにビューを突破クリックのオブジェクトツールバーで<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" />新しい表面アイテムを追加します。上をクリック<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> （次）。 </li><li>関心領域（ROI）を選択し、セグメントROIを分析する。表示エリアには、画像に重ね矩形ボーダー部にROIを表している。対応するX軸、Y軸、Z-フィールドに値を入力するか、直接ROIのサイズと位置を変更するために、プレビューの長方形の矢印をクリックしてください。クリック<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt;（次へ）。 </li><li>ソースチャネルとして、セレクトチャンネル3（ゴールド-BSA-ローダミンNPのための信号）。結果の面積の滑らかさを設定するには、円滑なオプションをチェックします。手動で値を定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。しきい値の、絶対強度オプションを選択します。 </li><li>閾値調整のために、手動オプションを選択して、値を設定します。視域では、表面閾値プレビューは灰色で表示されている。 </li><li>タブ分類表面に得られた表面は、様々な基準によってフィルタリングすることができます。デフォルトのフィルタは「&gt; 10ボクセルの数」、および他のフィルタは、「追加」をクリックして含めることができている。フィルタリングが必要でない場合は、[削除]ボタンをクリックして、すべてのフィルタを削除します。クリック<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> （次）。 </li><li>サーフェス作成を完了するには、上をクリック/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt;（仕上げ）を。オブジェクトのリストで、現在、アイテム·ボリュームと新しい作成表面について、未チェックボックスが表示領域に表示されます。 </li><li>統計情報をエクスポートします。さて、突破ビューで被験者の色は、その面積に応じて紫から赤に変わる。そして、「プロット番号エリア」テーブルには、統計情報（ 例えば、ID番号とオブジェクトの面積）を示している。クリックでExcelファイルに面1のすべての統計情報をエクスポート<img alt="アイコン" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> （保存）。 </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

哺乳動物細胞のエンドリソソーム系は、栄養吸収、ホルモン媒介性シグナル伝達、免疫監視、および抗原提示17を含む重要な生理的過程を制御する。これまで、種々のマーカーは、エンドサイトーシス経路および追跡調査を標識するために使用されてきた。例えば、リソトラッカープローブは、選択的に低い内部pHの細胞区画に蓄積し、効果的にナノモル濃度18に住んで細胞を...

金属などのNP、量子ドット、ポリマーのNP、シリカNPは、カーボンドットを含む、蛍光ナノ粒子（NPは）、過去数十年の間、1,2-かなりの注目を集めている。従来の有機染料に比べて、蛍光性NPは、このような強力な信号強度、光退色に対する抵抗性及び生体適合性の高い3,4のような望ましい化学的、光学的および機械的特性を示す。これらの利点は、それらの細胞内のセンシングと生細胞イメージングのための選択の方法にする。さらに、電子密度の高いNPの様々な生細胞の組み合わせは、光学顕微鏡（LM）とEM 5と超微細構造レベルでのより高い分解能でトラッキングすることができ、相関顕微鏡分析のためのそれらの使用を容易にする、電子顕微鏡（EM）から見える。例えば、金NPは、効率的に感受性の診断のための生細胞におけるバイオセンサーとして、ならびに免疫標識6の分野で使用される長い時間であった。最近のStudiesは、異なるサイズおよび形状を有する金NPが容易に大きな電位が細胞内小胞輸送の追跡およびエンドリソソーム系標識7,8を申請しているため、細胞株の大様々な取り込みおよび日常エンドソーム経路を介して輸送され得ることを示す。 そのようなサルモネラ·エンテリカ 、 赤痢菌およびリステリアなどの微生物病原体は、非食宿主細胞9に侵入するために異なるメカニズムを開発しました。内在化された後に、病原体のいずれかのサイトゾルに局在または膜結合区画に隔離は、それらのホスト環境で広範囲に相互作用して、自分の生存10を優先するように、これらを調節する。例えば、 サルモネラ·エンテリカは、細胞内ファゴソーム区画内に存在し、複製し、感染11上にサルモネラ含有液胞（SCV）と呼ばれる。成熟SCVエンドサイトーシス経路で連続的相互作用を受けてゴルジ装置に向かうトラフィック、およびサルモネラ誘発フィラメント（SIF）などの大規模な管状構造の形成を誘導するが、ネキシン細管ソート、 サルモネラ、分泌キャリア膜タンパク質3（SCAMP3）細管など誘発。12-14。これらの細菌性病原体が宿主細胞の経路を操作する方法勉強する感染症を理解するために不可欠です。 ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソーム系を標識するために流体トレーサーとして使用し、ヒトの胃腸病原体サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌（ サルモネラ ）と病原体の相互作用を研究するためのモデル菌として使用したエンドサイトーシス経路をホストします。 WT サルモネラまたは突然変異株を感染させた非感染細胞と細胞の細胞内の金BSA-ローダミンNPを、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で画像化した。その後IMARISソフトウェアはサルモネラ感染がエンドソーム/リソソームの極端な再配列を誘導したことを示す、NPの分布を定量した。この方法の説明に続いて、類似の実験は、内在化NPの長期の運命を追跡し、真核細胞のエンドサイトーシス経路上の様々な外因性物質または内因性因子の影響を調査するために設計することができる。

<table><tbody><tr><td>Gold chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>tissue culture treated, sterile</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>various configurations available</td></tr></tbody></table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

望ましい化学的、光学的および機械的特性を有する蛍光ナノ粒子（NPが）、細胞内小器官を標識するための有望なツールである。ここでは、真核細胞のエンド-リソソームシステムにラベルを付け、細胞内病原体サルモネラ·エンテリカによりホスト細胞経路の操作を監視するために金-BSA-ローダミンNPSを使用する方法を紹介します。 NPは容易に後期エンドソーム/リソソームにHeLa細胞によって内在して局在していた。 サルモネラ感染症はSalmonella-誘起膜構造における小胞およびNPの蓄積の再配置を誘導した。我々は、共焦点顕微鏡画像の定量分析のためのIMARISソフトウェアパッケージを展開。非感染細胞内のオブジェクトの数とそれらのサイズ分布は、WT サルモネラによってエンドリソソーム系の非常にリモデリングを示す、 サルモネラ感染細胞におけるものとは異なっていた。

金NPは、クエン酸、タンニン酸による塩化金酸の還元を介して、十分に確立された方法により作製した。 図2Aに示すように、合成された金NPは、約10nmのサイズを有する形状に準球形であった。 BSA-コーティングおよびローダミン標識は、それらの形態や大きさ（ 図2B）に影響しませんでした。 これは、金NPは容易に種々の哺乳動物細胞により取り?...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K ビュー.  Universität Osnabrück. この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。 

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

生化学

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

免疫・感染学

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

神経科学

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

生物学

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

SNARE人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

エンドサイトーシス、エキソサイトーシスの概要

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

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JoVE Science Education

高等生物学

細胞生物学

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

蛍光イメージングによるニューロンの小胞運動の可視化

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...

細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

要約

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