この作品は、国立心臓と肺研究所（R01 HL086582）とニューヨーク幹細胞科学基金（NYSTEM、契約＃からの補助金によってサポートされていました &#160; STAとジョン·ナイキストによって完成したJoveのビデオで使用されるDDSイラストにC024316）;バッファロー、ニューヨーク州立大学のメディカルイラストレーター。

注：このプロトコルは、バッファローのニューヨーク州立大学で動物実験委員会によって承認されています。 1.手術前の準備<ol><li>以下の研究のために（40〜60の体重で約1-3歳ドーセットクロス、女性、）羊を使用してください。手術の前に3日から始めて、口の中にシクロスポリンA（200mg /日）、アスピリン（975 mg /日）、及びクマジン（20〜30 mg /日）を管理し、すべての研究の期間継続する。 </li><li>羊は手術（通常の飼料= 1.8キロの干し草と0.4キロ粒）の前に12時間絶食させていることを確認します。 </li><li>蒸気121℃のオートクレーブで30分間15psiのを使用して、すべての外科用品を殺菌する。 </li><li>手術前にパラホルムアルデヒドのデシケーター48時間で次の項目を配置します：4ミリメートルドップラー流量プローブ、1ミリメートルの超音波の結晶、留置動脈カテーテル、延長チューブ、および42「タイゴンチューブを。 注：のために必要な、関連する医療機器のテーブル手術と殺菌のためには、 表1に記載されています。この段階でタイゴンチューブに計装の事前配置は、手術中に時間を節約するのに役立ちます。 <ol><li>左及び該当する場合は、右のようにプローブ、カテーテルおよび結晶の両端にラベルを付けます。 </li></ol></li></ol> 2.手術<ol><li>ジアゼパム（0.5ミリグラム/ kg）およびケタミン（4ミリグラム/ kg）を静脈内（IV）で麻酔するための羊を誘導する。また、テラゾール（4 mg / kgを）IVを使用しています。 <ol><li> 8.5〜10.0ミリメートル、内径カフ付き気管内チューブ7と経口気管内挿管を行います。 </li><li>一回換気量の換気装置（7〜10ミリリットル/ kg）または圧力調整式人工呼吸器に再呼吸回路を介して吸入麻酔を投与する（15〜20センチメートルH 2 O）。深い外科麻酔ステージにメディアに到達するために適切な量（3％-4％、当初）でイソフルランまたはセボフルランを管理するための精密な気化器を使用してください。の最小肺胞内濃度羊は1.4％以上、それぞれ1.9％8である。 </li><li>運動刺激に応答して、眼瞼反射、目の位置、および心拍数を観察することにより、麻酔深度を評価する。パルス酸素濃度計を用いて血液の酸素飽和度（95％-100％）はカプノグラフィーを使用して、呼気ガス中のCO 2濃度（45〜55 mmHg）で、監視し、自動調整さ加温ブランケットを使用して、手順（38.5から39.5℃）中に体温を維持する。 </li></ol></li><li>標準バリカンの＃40ブレードを使用し、羊の全体首から、そして1橈側皮静脈の上にウールを剃る。 70％のイソプロピルアルコール、7.5％ベータダインスクラブ飽和ガーゼを使用した手術のための両方の部位の皮膚を準備します。皮脂の除去を容易にするために、アルコールガーゼで始まる。ベタジンガーゼとアルコールとの代替を三回ガーゼ。 </li><li>加温ブランケットの上に背側横臥位で動作テーブルの上に羊を置きます。胃内容物の受動的な追放を可能にするために、中規模の経口胃管を渡します。拡大する羊の首と、必要に応じて配置を維持するために協力的緩衝材を使用しています。 <ol><li> 7.5％ベタジン浸したガーゼを使用して、最終的な無菌スクラブを行い、手術前に5分間座ってすることができます。 </li></ol></li><li>橈側皮静脈に配置された血管カテーテルを通して10ミリリットル/ kg /時間での静脈内輸液（乳酸リンゲル液または0.9％生理食塩水）を管理。ペニシリンGプロカイン6600 U / kgを筋肉内（IM）、ゲンタマイシン1.6 mg / kgを、IM、およびブプレノルフィン0.005から0.01 mgのIVまたはIM：術中抗生物質や鎮痛を管理します。 </li><li>電気焼灼を使用して腹側正中首の上に縦に~12センチ切開する。鈍的切開技術を用いて結合組織を除去することにより、左右の頸動脈（1~6 cm）を単離する。オフネクタイと出血を最小限にするために頸動脈から分岐したマイクロ血管を焼灼する。 </li><li>すべての配線とチューブ（フロープローブ、超音波水晶ワイヤーを掘り進むを支援するために（非滅菌）の手術看護を利用することにより、無菌性を維持皮膚の皮下層内のカテーテルチューブ）。背外側首に外科的に準備さ切開を通って出る鈍いトロカールを使用してください。 <ol><li>無菌ドレープの下に到達し、首の側はドレープの下で可視化することができるように、羊の頭を回す。 </li><li>腹側正中頸部切開と首の側との間の皮下空間を介してトンネルに8センチメートル湾曲した止血剤を使用してください。オープンとぶっきらぼうに幅1.5cmの管〜のためのスペースを解剖するために止血剤を閉じます。止血のヒントは、頭と肩の間の中間に右または左耳に尾約10cmを配置する必要があります。ヒントは表面的な皮膚に向かって指しているように止血剤を回します。 </li><li>無菌ドレープの下にリーチし、滅菌＃11ブレードと止血剤の先端の上に、皮膚を介しての1.5cm切開する。皮膚を通して明確な終了を確認する止血のヒントを視覚化する。 </li><li>含むタイゴンチューブを渡す皮下トンネルを通してLL配線とチューブ。無菌ドレープ上記ワイヤーとチューブを保持する。 </li><li>それは羊の首を離れるとして移植配線を露出させ、首から外側のタイゴンチューブを削除するにはドレープの下に達する。皮下空間内の任意の緩みを最小限に抑えるために、個々の行を引き出します。適切に動脈に機器を取り付けるための十分な距離にしておきます。 </li></ol></li><li>両方の頸動脈に4ミリメートルドップラーフロープローブを配置し、初期読み取ります（ 図1）を達成する。動脈をクランプする前に、ヘパリンIVの30分の100 U / kgのを管理します。 </li><li>手術の終了まで100 U / kg /時間でのヘパリン投与を継続します。非破砕血管クランプを使用して頸動脈をクランプ部分（長さ約4 cm）を切り出す。対側頚動脈流量は、脳への血流を維持するために、50％-100％に増加する。 注：これは、除去することによって本来の​​血管の反跳によって縦延伸を制限することが可能である置き換えおよび/または完全な吻合手順が完了するまでの間隔を短くするために血管クランプを使用してネイティブ動脈延伸さより短いセグメント。これは、個々の保持縫合糸の張力と移植された移植片を制限するのに役立ちます。 </li><li> 7-0プロリンethalloy重武装したモノフィラメント縫合糸でシンプルな中断されたステッチを使用して所定の位置にTEVを縫合。必要に応じて、吻合の縫合を妨げるであろう血管収縮を防止するために、天然の血管系に局所的にそのようなパパベリンた（15mg / ml）またはニカルジピン（1.25 mg / ml）での血管平滑筋弛緩剤を適用する。 注：約1ミリメートル間隔で縫合糸を配置することから始めます。これは非常に、場合に変化することができる。組成やTEV厚さは、縫合糸との間の有効距離に影響します。天然の組織またはTEV減少の厚さとしては、互いに接近、縫合糸を配置する必要があるかもしれない。 <ol><li>二つの対向するSを配置することによって、ネイティブ動脈にまずアンカーTEVの4点近位端および遠位端（図2 -Di）の両方でtitches。止血剤を使用して教えた各アンカーを持ちます。 注：近位および遠位の説明は、紙全体に血流の方向に関連している。 </li><li>吻合を開始するために、近位端および遠位端の両方の表面的な側面に5-6以上の縫合糸を追加します（図2 -Pr）。同時に血管を180度回転させるクランプ。 </li><li>繋留縫合糸の張力を再確立する。 TEVの回転側（5~6）近位ために縫合糸端部および遠位端部を追加的に中断加える。 </li></ol></li><li> TEVがしっかりと所定の位置に縫合された後、元の位置にそれを回転させ、第一、血管は、一度に1つをクランプ遠位クランプを外す。吻合部位でのわずかな出血が一般的です。これは自然にクランプ解除とreclampingの数分後に解決するか、追加の縫合糸の配置が必要な場合があります。 （ 図3ドップラーフロープローブを配置バックTEV入る血流及びモニタ流量に対するネイティブ動脈の近位に-Fl）。 注：左右の頸動脈の流量は、約15分後に平衡化することを期待。移植されたTEVと頚動脈における流量が着実に低下した場合には、TEVが凝固されることが可能である。流れに関する他の可能な異常がTEVに対して近位または遠位ネイティブ動脈の収縮に起因することができます。この問題が発生した場合、追加の血管平滑筋弛緩剤の使用が適用されてもよい、と本来の血管は、移植部位上の組織の閉鎖後30〜60分後に、基礎トーンに返す必要があります。 <ol><li>必要に応じて、対側頸動脈を切除し、「シャム」対照としての所定の位置に戻し、それを縫合。これは、より臨床的に関連する単独の右頸動脈を残すのみフロープローブ、超音波クリスタル、及びカテーテルを取り付けるよりも長い。シャム制御が望まれる場合は、2.11のステップに続行する前にこれを実行。 </li></ol></li><li> 7-0プロリンを使用したTEVの両側に1ミリメートルの超音波結晶（ 図3 -cr1 CR2）を縫合。超音波クリスタルヘッドを通して縫合糸を通し、唯一のTEVの表層にステッチ。 </li><li>テフロン織り前立て（ 図3のCa＆図4A）で修飾18 Gカテーテルを用いて動脈をカテーテルを挿入。ネイティブ動脈組織上のTEVに対するカテーテル遠位に配置します。 <ol><li>出血を制御するために5/0 Ethibondで動脈壁に前立てを縫合。生理食塩水でフラッシュされたカテーテルにマイクロボアチューブを接着するためにシクロヘキサノンを使用してください。補助線としてチューブを使用してください。 </li><li>チューブの体外に終了します（ 図4B）を密封するためにSurfloインジェクションプラグ付き20 Gルアースタブアダプターを使用してください。カテーテルの開通性を維持するために、2〜3日ごとにラインのプライミングボリュームを取得し、食塩水10mlでそれをフラッシュヘパリンナトリウム注射、次いで5000 U / mlの。 </li></ol></li><li>フロープローブと超音波の結晶、ならびにフロープローブとカテーテルとの間の距離との間の距離を記録する。これはソフトウェアに関連して算出する脈波伝播速度を可能にする。このような計算を必要としない場合、カテーテルを移植しない。 </li><li>機能しているすべての移植ハードウェアを確実にするために必要に応じて手術中の測定値を取得する（セクション3を参照）。 </li><li> 2/0シルクとテーパー針（ 図3）を使用して、近くの筋肉組織に注入された線や電線を固定します。 <ol><li>プローブ尾とワイヤー頭側拡張してから、横の筋肉組織に向けて「Uターン」ことで、容器に血流プローブ線と平行に配置します。ワイヤーまたはフロープローブは、容器上の任意の歪みを配置することができないように、2箇所にテーパー針に2-0シルクを使用して、隣接する筋肉組織にワイヤを固定します。縫合糸がしっかりされていることを確認しますが上musculaを締めとstrangulateはありませんトゥーレ（ 図3）。 </li><li>フロープローブを固定するための前述の手順と同様のたるみ~1.5センチ（ 図3）を考慮して、横方向の筋肉組織に結晶配線および動脈カテーテルラインを縫合。 </li><li>一緒にグループすべてのワイヤや線、ちょうど前のステップと同様の皮下トンネル、を通って出る前に筋肉組織にそれらを固定する。 </li></ol></li><li> （;針をカット、皮膚フェーシャ、非切削針）皮膚にマットレスステッチを実行して、フェイシアと真皮下で実行されている縫合パターンを用いた層で2-0ビクリル縫合糸により手術部位を閉じます。 2/0のVicrylとカッティング針を用いて体外に電線や線の周りの背側頚部で1.5センチの切開を閉じます。 </li><li>しっかりと羊（ -回復した後の図5）の皮膚に縫合されるパウチに置きフロープローブワイヤ、カテーテル線、超音波水晶ワイヤ（×10cmの10cm）に。 </li><li>徐々にオフ麻酔羊を引き離す自発呼吸が再開されたときと一回換気量の換気装置はその後羊を抜管。必要に応じて橈側皮静脈と包帯に挿入された血管カテーテルを削除します。 </li><li>切開、Telfaパッド、ストレッチロールガーゼ、及びエラスチコンにトリプル抗生物質軟膏を使用して首を包帯。 </li><li>一日一日二回ブプレノルフィン0.005から0.01 mgのIVまたはIM、2日間1日1回の回復中に一度フルニキシンメグルミン2.2 mg / kgをIM、その後1.1 mg / kgをIM：術後鎮痛を管理します。 </li></ol> 生体内の監視3. <ol><li>適切な拘束を​​確実にするために、モバイルカートに羊を置きます。これは羊は、ハードウェアを損なうことなく、穏やかで意識したまますることができます。計装録音を得る前に30分間カートに2〜3回の羊を順応する必要があるかもしれません。 </li><li>袋からすべての配線や線を削除し、監視装置に接続します。流量計フロープローブを接続し、1ミリメートルの超音波結晶TRBに接続-USBボックス、及び圧力トランスデューサのカテーテルライン。この設定のフローチャート（ 図6）が設けられている。 </li><li>流量プローブおよびデータ収集に先立って圧力変換器を校正。 注：、ソフトウェアのバージョンや使用される機器の違い、キャリブレーションや設定の間の電位の変動に、場合によって異なります。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、微調整Sonometrics結晶測定をオシロスコープを利用する。 </li><li>コンピュータソフトウェアを使用して記録データ（ 図7）。赤い色の下半分にトレースはシャム/ネイティブに対応している白色で、図7の上半分でトレースは、移植されたTEVに対応している。 TEVとシャム流量（ml /分）、動脈圧（mmHgで）及び直径（mm）の両方のためにライブ記録されている。 </li><li>無擾乱少なくとも1分間の記録。より詳細な分析のためにこのデータをエクスポートします。記録後、DISCONNECTすべてのワイヤと背中羊の首に縫合ポーチに入れる。 </li></ol>

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このレポートの目的は、ヒツジ頸動脈への関心のインプラントTEVSに信頼性と再現手順を提供することにある。このモデルで使用される動物の天然の頸動脈は、厚さ0.5〜0.75ミリメートルおよび外径4.5〜5ミリメ​​ートルであった。ここで説明する外科技術は、厚さが0.25〜1ミリメートル、外径4〜5ミリメ​​ートルと3ヶ月の期間までの効果的な証明して大きな成功を収め、意図されたエンド?...

TEVSの開発のための主な焦点は、自家血管が利用できない場合、自家移植片の交換のための代替を提供するために、ドナー視力罹患率を制限することであった。例えば、年間冠動脈バイパス手術の数は、アメリカで35万超えている、との適切な移植片の理想的な供給源は、左内胸動脈、冠動脈及び伏在静脈1を左前下のまま。血管疾患に苦しむ多くの人々は、自家移植片の交換に適し動脈と静脈を持っていない可能性があるため、TEVSの開発は、このように何十年も1-6のための研究の強烈な分野となっています。小説TEVSのエンジニアリングおよび最適化は、自身がそのような激しい議論の話題となっていないTEVSを移植するために採用外科技術に関する報告、多くの進歩を遂げているが。そうではなく、動物モデルにTEVSの移植に関するプロトコルは大きく残されている研究研究者まで。 以下の原稿は、エンドツーエンドの吻合法を利用してTEVSを移植する方法を示します。この手順は、長手方向の張力およびインビボのモニタリング器具の添加を最適化する、縫合技術の安定化、特定の吻合部の縫合パターンを用いて最適化した。この方法は、以前に使用されてきた多くのバリエーションの一部と対比される。さらに、この手順は、動脈血圧、TEV直径/コンプライアンスなどのパラメータを取得し、外植までアップ手術後TEVを通して流速する方法について説明します。それはリモデリングの過程にある間、このデータ収集はTEVの不可欠な分析を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1505">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td dir="LTR" height="43" style="height:43px;width:335px;">Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Manufacturer</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">Serial/Catalog #</td>
			<td dir="LTR" style="width:363px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td dir="LTR" height="94" rowspan="2" style="height:94px;width:335px;">Pressure Transducer</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Becton Dickinson</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">P23XL-1</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each artery) 
			&#160;Used with water-filled diaphragm domes</td>
		</tr>
		<tr height="172">
			<td dir="LTR" height="172" style="height:172px;width:335px;">Amplifier and transducer box</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Gould</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">5900 Signal Conditioner Cage</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1 
			Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td dir="LTR" height="121" style="height:121px;width:335px;">T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module(x2)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Transonic Systems</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">T403 module and TS420 (x2)</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1 
			Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td dir="LTR" height="126" style="height:126px;width:335px;">Digital ultrasonic measurement unit</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">Sonometrics</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">TR-USB</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td dir="LTR" height="48" style="height:48px;width:335px;">Flow Probe Precision S-Series 4mm</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:208px;">Transonic Systems Inc.</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:311px;">MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:291px;">2</td>
			<td dir="LTR" rowspan="4" style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="49" rowspan="2" style="height:49px;width:335px;">1mm&#160; Sonometrics Crystals</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Sonometrics Systems</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">1R-38S-20-NC-SH</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">&#160;2-4 (2 for each artery)</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td dir="LTR" height="134" rowspan="2" style="height:134px;width:335px;">Catheter for implantation</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">BD (Becton Dickinson)</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">&#160;381447</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">&#160;1+ (1 for each artery) 
			Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="73" rowspan="2" style="height:73px;width:335px;">Tygon Microbore Tubing</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Norton Performance Plastics</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">(AAQ04127) Formulation S-54-HL</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">NA (cut to length for an extension set)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="49" rowspan="2" style="height:49px;width:335px;">Luer Stub Adapter</td>
			<td dir="LTR" style="width:208px;">BD (Becton Dickinson)</td>
			<td dir="LTR" style="width:311px;">427564 (20 gauge)</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each arterial catheter)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="82" rowspan="2" style="height:82px;width:335px;">Surflo Injection Plug</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">Terumo</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">SR-IP2</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">1+ (1 for each arterial catheter)</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td dir="LTR" height="128" rowspan="2" style="height:128px;width:335px;">Meadox</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:208px;">PTFE (Teflon) Felt</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:311px;">19306</td>
			<td dir="LTR" style="width:291px;">NA (cut to size) 
			The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as &#8220;Surgical Mesh&#8221; offer products which are equivalent.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical technique for the implantation of tissue engineered vascular grafts and subsequent in vivo monitoring

組織工学的船（TEVS）の開発は、大動物モデルへの能力に日常的にかつ効果的にインプラントTEVS（直径4-5 mm）で進められる。ステップバイステップのTEVの間の位置に配置するためのプロトコルおよびTEVネイティブ頸動脈のリアルタイムデジタル評価は、ここで説明されている。 インビボ監視は、流量プローブ、カテーテル、および超音波結晶（可能な注入によって可能にされる手術時に移植さTEVSネイティブ頚動脈）の動的な直径の変化を記録する。一度移植、研究者は、動脈血流パターン、観血血圧や、脈波伝播速度、振幅増加指数、パルス圧およびコンプライアンスなどのパラメータをもたらす動脈直径を計算することができる。データ収集は、実験期間を通じて分析のために、単一のコンピュータプログラムを使用して達成される。このような貴重なデータがTEVマトリックスリモデリングへの洞察を提供し、そのresemblanネイティブ/偽対照およびin vivoでの全体的なTEV性能にCE。

30以上の羊は、（印刷中）TEVSの移植のために、この報告書に記載されて外科技術9を受けている。プロトコルの最適化の後に、最新の羊操作をまとめた表を表2に示す。すべての羊のない生命を脅かす合併症を持つTEV注入後に回復した。いくつかの動物では、線維症は、留置動脈カテーテルの先端付近ネイティブ動脈で観察された。追加されたインスツルメンテーションの...

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Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

動物の屠殺まで、インビボでのエンドツーエンドの吻合およびリアルタイムデジタル評価を用いて、ヒツジの頸動脈への組織工学的船（TEVS）の間の位置に配置するためのステップバイステップのプロトコル。

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技<em&gt;インビボ</em&gt;モニタリング

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

surgical-technique-for-implantation-tissue-engineered-vascular-grafts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

11.6K ビュー.  State University of New York Buffalo School of Medicine. 動物の屠殺まで、インビボでのエンドツーエンドの吻合およびリアルタイムデジタル評価を用いて、ヒツジの頸動脈への組織工学的船（TEVS）の間の位置に配置するためのステップバイステップのプロトコル。 

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

生物工学

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

大きな腱欠損を修復する組織設計されたコラーゲン移植片を用いた新規テノルラフィー縫合技術

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

ラットでの肝部分工学生体内での基盤として新しい手術手技

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...