The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

注：準備、データ収集及びデータ解析ステップを含むプロセスフローの概要について、図2を参照してください。 1.試薬のセットアップ注：すべての化学物質は、取り扱いに注意しなければならないため、白衣、手袋と目の保護を使用する必要があります。すべての操作は、実験室フード内で実行する必要があります。具体的には、特別な手袋はクロロホルムを用いた場合に着用してください。 <ol><li>急速にそのような乾燥クロロホルムなどの低含水量で化学薬品を使用し、週間以上乾燥ではなく、保管してください。 APTES（（3-アミノプロピル）triethoxysilanが）およびPEG（ポリエチレングリコール）（ 表1参照）ため、-20℃で、窒素またはアルゴンガス下で両方の化学物質を保管吸湿性であり、PEGは、空気中で酸化を受ける。 </li><li>大気中の酸素や水分に株式の頻繁な露出を避けるために、理想的に窒素を用いてグローブボックスシステム内で、小さいアリコートを準備atmosphe再。 </li></ol> 2.機器のセットアップ注：可能な交差汚染を回避するために、ステップごとに新鮮できれいな容器を使用する。 <ol><li>きれいなガラス器具および60℃の超音波浴中で30分間、界面活性剤溶液中でピンセット。 </li><li>超純水で2回徹底的にステップ2.1から機器をすすぎ、超音波処理。 </li><li> RCA溶液中のステップ2.1からの熱機器（超純水、過酸化水素及びアンモニア（5：1：1））に75℃で45分間オーブン中でC、その後、超純水でそれらをすすぐ。 </li><li>最後に、乾燥窒素気流下、オーブン（100℃、3時間）でガラス製品、ピンセットを乾燥する。 </li></ol> 3.ヒント機能化 NOTE：ピンセット、船舶等は、ステンレス鋼、PTFE、ガラス、または該当する場合は、有機溶液中で化学的に安定である任意の他の材料から作られる。特に断りのない限り、Rにおける全てのステップを実行するT.必要なインキュベーション溶液の量は、カンチレバーチップの数に依存する。カンチレバーはすべての時点でそれぞれの溶液に浸漬されていることを確認します。 注：有機蒸気の吸入を避けるために、フードを使用してください。 <ol><li>カンチレバー表面上のOH基の形成（「活性化」）（約0.5時間）。 <ol><li>きれいなガラススライド上に、プラズマ室（100 W）に入れ、新鮮なカンチレバーチップ（10〜100 PN / NM：：SiNから、バネ定数材料）を配置するためにピンセットを使用してください。 </li><li>チャンバー（〜0.1ミリバール）を避難させる。 </li><li>酸素ガスとの洪水室と再び避難する。 </li><li> （20％、継続時間：15分、プロセス圧力：0.25ミリバールパワー）プラズマプロセスをアクティブにします。 </li></ol></li><li>カンチレバーのアミノシラン（約1時間）： <ol><li>プラズマプロセス中に、理想的には、これを行う- APTES溶液を2.5mlを調製し、ガラスシャーレ（ 表1参照）。 </li><li> Immediatelプラズマ処理後のYは、アセトン中で1秒間各カンチレバーを浸しAPTES溶液中で直後に配置します。 </li><li> RTで15分間インキュベートする。 </li><li>慎重に10ミリリットルのアセトンに一回10ミリリットルのクロロホルムに二回カンチレバーチップをすすぐ。 </li><li>任意の最終ステップ：清浄なガラススライド上に前工程からのプレースカンチレバーチップを70°Cで30分間、それらを焼く。表面活性化、 例えば、UV処理12のための代替戦略もあることに注意してください。 </li></ol></li><li> PEG化（約2時間）： 注：手順を実行し3.3.1-3.3.4アミノシラン中に。 NHSおよびマレイミド基は、水性環境中で加水分解を受けやすいとPEG自体は空気中で酸化の対象となります。そのため（特にステップ間で）タイミングは重要なパラメータである。詳細については13を参照してください。 <ol><li>クロロホルム溶液を（ 表1参照）を準備。 </li><li>結露を避けるために、、暖かいPEGは分量を開き、適切な量を計量する前に、室温まで粉末。 </li><li>アミノ基を有するポリマー又は脂質の結合のために、個別にそれらが完全に解決されるまで、それらをボルテックスすることにより、クロロホルム溶液中でNHS-PEG-NHS（6 kDa）のメチル-PEG-NHS（5kDaの）を解く。濃度については、表1を参照してください。 <ol><li>代わりに。チオール基を有するポリマーのカップリングのために別々にクロロホルム溶液中のMal-NHS-PEGとメチル-PEG-NHSを解決する。 </li></ol></li><li> NHS-またはマレイミドおよびメチル末端PEG分子（：500、典型的には1）との​​間に一定の数の比を調整するために必要に応じて溶液を混合する。理想的な比率は、準備、実験一連のサイクルで反復的に決定されなければならないことに留意されたい。 </li><li>クロロホルムの蒸発を防止するためにクロロホルム、飽和雰囲気中で1時間PEG溶液にカンチレバーチップをインキュベートする。 </li></ol></li><li>分子抱合を探る（&gt; 1時間）。 注：以下の3.4.1-3.4.3では、AFMチップの異なるプローブ分子の共有結合のための3つの例が記載されている。各分子のためのプロトコルを調整する必要がある。実施例1及び3-NHS化学で実施例2において、チオール官能化ポリマーPI- gが -PSがマレイミド化学を介してPEGに結合され、一方、使用されていることにも注意。詳細については、14を参照してください。 <ol><li>ポリ（アミノ酸）、ポリ-D-チロシン（40-100 kDa）のための<ol><li> 1MのNaOHでポリチロシン共役プローブ分子を溶解させる。 1 mg / mlの濃度に調整。 </li><li>官能化の直前にスピン脱塩カラム（7 kDaのMWCO）を用いてホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 8.1）のためのNaOHを交換</li><li>その後のホウ酸緩衝液5ミリリットルとエタノール5ml、最後にして、クロロホルム5mlで最初のカンチレバーをすすぐ。 </li><li>ポリチロシンホウ酸緩衝溶液中で1時間、カンチレバーチップをインキュベートした後、ホウ酸緩衝液ですすぎ超純水。測定まで超純水に保管してください。 </li></ol></li><li>線形バックボーン（ポリイソプレン、119 kDaの）を有するグラフトされた側鎖（ポリスチレン、88 kDa）の14を有するポリマーについては、 <ol><li>乾燥クロロホルムにPI-G -PSを溶かす。 4 mg / mlのへの接合溶液の濃度を調整します。 </li><li>クロロホルム5mlのカンチレバーをすすぎ、共役溶液中で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li>クロロホルム5mlに再度リンスし、クロロホルム飽和環境でクロロホルム中で測定まで保存し（クロロホルム蒸発を防ぐため）。 </li></ol></li><li>脂質POPEのために<ol><li>乾燥クロロホルムにPOPEに溶解する。 20 mMの濃度を調整します。 </li><li>脂質溶液中で1時間、カンチレバーのインキュベーション前に5mlのエタノールと超純水5mlを有するカンチレバーをすすぐ。 </li><li>インキュベーション後、5mlのクロロホルム、エタノ5mlでカンチレバーをすすぐlで（この順序で）暖かい、超純水5mlの未結合プローブ分子を除去し、クロロホルム残基を取り除くために。すぐに官能化されたヒントを参考にしてください。必要になるまで代わりに、クロロホルムに保管してください。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> 図1 NHS化学の例を用いて、先端官能化プロセスを示す（A）概略図。 （B）化学結合は、アミノ基を介して先端にプローブ分子を取り付けるために採用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.表面の準備<ol><li>自己組織化単分子膜（SAM） 注：最初に、例えば表面が、自己組織化単分子膜を選択した。文献15を参照してください</s詳細については、&gt;まで。 <ol><li>それぞれ30分間超音波浴中の洗剤溶液および2回、超純水でクリーンなガラススライド。次に、追加の洗浄工程として、15分間、75℃で（ステップ2.3参照）RCA溶液中に置く。 </li><li>コー​​ト10nmのクロム、ニッケル、真空コーター中で100nmの金でスライド。そして、前に次のステップに直接RCA溶液中に再び冷蔵庫、清潔に保管してください。 </li><li> 12時間2 mMの1-ドデカン/エタノール溶液中に前の手順のスライドをインキュベートします。チオール基は金表面に結合した疎水性単層自己アセンブル。エタノール、超純水でスライドをすすぎ後、窒素ガスの流れによるドライ。 CCDカメラ10とゴニオメーターでの静的接触角測定と調製された表面の疎水性を確認する。 </li></ol></li><li>水素終端ダイヤモンド 注：第二の例のための表面としては、水素終端ダイヤモンドが選ばれました。以前に16記載のように表面処理を行った。 </li><li>サポートされている脂質二重層 注：最後の例では、表面支持された脂質二重層（SLB）を表面として使用した。そのような表面を得るために、リン脂質POPCからなる大型の単層小胞（LUVを）の溶液（0.1 mg / mlで）を押出法により形成した。その後、LUV溶液50μlを、新たに切断したマイカシート（A = 1 cm 2で）上に置き、30分間インキュベートした。最後に、この溶液を超純水20mlで洗浄した。のSLBの準備の詳細については、17,18を参照してください。 </li></ol> 5.データ集録注：実験では、液体中で測定する機能を提供し、AFMを使用します。データ収集およびデータ分析手順は関係なく使用AFMモデルの適用可能である。さらに、いくつかの実験ではtemperaturを制御する可能性を有することが有利である液体セル内の電子。カンチレバーの偏向は、レーザビームの偏向方法19を介して検出した。ばね定数は、熱雑音法20を用いて測定した。 <ol><li>体液中の測定に適しているAFMカンチレバーホルダーに官能化カンチレバーを挿入します。 </li><li> AFMにサンプリングされる（調製は上記参照）の表面を入れて、液体でそれをカバーしています。どちらも、カンチレバーと表面が今表面に向かって指しているカンチレバーの先端で液中に浸漬する必要があります。多くの場合、液体の滴が十分であることに注意してください。いずれの場合においても流体の蒸発は、閉じた流体セルを用いて、例えば 、避けるべきである。 </li><li>該当する場合、コントローラ上の所望の温度を調整します。 </li><li>システムは、少なくとも半時間平衡化しましょう​​。 </li><li>効果を減衰任意の表面を除外するために、遠く離れた表面からカンチレバーとカンチレバーの熱雑音スペクトルを記録します。通常1ことに注意してください0以上のスペクトルは、十分な信号対雑音比を得るために、蓄積されなければならない。 </li><li>表面アプローチ。先端形状と先端官能化を節約するためにアプローチプロセスは注意深く行わなければならないことに留意されたい。これは、間欠接触モードで接近、例えば、によって達成することができる。 </li><li> NM /ボルトで測定された逆の光てこ感度（InvOLS）を決定します。硬い表面に対してカンチレバー先端を押すことでこれを行います。 <ol><li>フォトダイオード電圧の変化対ピエゾ移動距離の傾きを測定することにより、InvOLSを決定します。カンチレバーの先端が表面に接触している力 - 距離曲線の一部にラインを取り付けます。脂質二重層のようなソフト面を含む実験では、脂質二重層（「欠陥スポット」）で覆われていない領域でこの手順を実行する。 </li></ol></li><li>熱雑音スペクトルに高調波発振器を適合させることによりバネ定数（PN / nm）を決定します。使用ばね定数決定のための自動化されたソフトウェア機能と、そうでなければ文献20を参照してください。 </li><li>実験を開始します。 <ol><li>各実験条件での数々の力 - 距離曲線を記録します。 1μmの距離を撤回、5 kHzの、1ミクロン/秒の先端速度のサンプリングレート：通常、実験パラメータに次の値を使用します。 注：場合によっては、検討した実験のダイナミクスに応じて、それは（「滞留時間」）の表面に接触して先端にある程度の時間を待機する必要があるかもしれない。 注：この実験特有のパラメータは、上記の値から大幅に逸脱することができます。 </li><li>長期の測定中に、フォトダイオードを再配置することによって随時フォトダイオード上のレーザ位置をゼロ。 </li><li>オプション：すべての力曲線の後、別のXY位置にAFMチップを再配置。 </li><li>実験の終了時に、感度およびスプリングを決定CONSTAシステムの一貫性および安定性を確認するために再度のnt。 注：実験前と後のばね定数と感度を比較することは、システムの特性およびチップの特性は実験の過程にわたって変化しないままであったことを確実にするための手段である。ばね定数の差が（&lt;= 15％）が大きすぎない場合には、バネ定数の決定の本質的な不確実性も15％程度であるので、それらは、平均することができる。大きな違いの場合は、最初に見つけると、さらなる実験を続行する前に、変化する見かけのばね定数の原因を排除することをお勧めします。 </li></ol></li></ol> 6.データ準備注：典型的には、ニュートンとナノメートル単位を変換するだけでなく、データが記載されている修正するための実験の特定のタイプとは無関係に行われ、このセクションの一般的データ準備工程において。実験特定のデータ分析はBRであるieflyそれぞれの代表的な実施例のセクションで以下にさらに説明する。 <ol><li>一般的に、すべてのデータの準備を行い、解析ソフトウェアIGOR Proを6に基づいて、 例えば家庭書き込まアルゴリズムによって自動的に繰り返す。 </li><li> InvOLS [NM / V]とばね定数[nNの/ nm]とでそれを掛けることによって発効[V]生の偏向信号（DEFL）を変換します。 </li><li>表面（アンロードカンチレバー）から十分な距離でカンチレバー上の力が0 NNのになるように力を相殺した。 </li><li> ：実際の先端位置（表面に対して測定した場合にも、分離と呼ばれる）を考慮にカンチレバーの曲げをとるのz *を計算する <img alt="式1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> のz * = 0は、表面のz位置に対応するように* zのオフセット。 注：ここで、Fは 、したがって、先端に作用する力であり、曲げ（ステップ6.2で決定された。）は、カンチレバーのs、zは測定されたz軸センサ位置（直接計器により与えられる）、kは （ステップ5.8で決定された）ばね定数を表している。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> サンプル調製、データ収集とデータ分析を示す図2.プロセスフロー図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

最後の数十年の間に、単一分子実験は分子メカニズムに前例のない洞察を提​​供し、生命科学とそれ以降で非常に貴重なアプローチであることが判明しました。 SMFS実験の良い有意義な統計値を達成するために、理想的には、同一の分子は、実験の全体​​にわたって使用されている。分子のアンサンブルを用いた実験とは対照的に、SMFS実験は稀な事象と隠された分子状態を検出すること?...

過去30年間に、原子間力顕微鏡（AFM）は、すべての3つの次元での分子の空間分解能を提供し、様々な溶媒中で動作させることができるので、生物学1,2および合成3の材料および表面を研究するための貴重なイメージング技術であることが判明している環境。加えて、AFM-単一分子力分光法（SMFS）はpNからμN政権に至るまで力を測定することが可能になり、4,5の折り畳みタンパク質に例えば前例のない洞察を与えている、高分子物理学6から8、および単一分子-表面相互作用9 -単一分子ではなく、分子のアンサンブルを研究の背後にある12 .theの根拠は、多くの場合、稀な事象や隠された分子状態をマスクする効果を平均化することを避けることである。さらに、このような等輪郭長、クーン長、接着自由エネルギー、などの分子パラメータの多数であることができる得。これは、以下の実施例に詳述されている。典型的なAFM-SMFS実験では、プローブ分子は、リンカー分子を介して非常に鋭い先端部に連結されている。チップ自体は曲げられる片持ち梁の端部に配置されている。先端が表面と接触した場合、プローブ分子は、この表面と相互作用する。表面から分子を分離するために、先端部の後退時にカンチレバーのたわみ、力、ひいては自由エネルギーを観察することによって決定することができる。意味のある統計値を得るために、いわゆる力 - 距離曲線の多数を取得しなければならない。さらに、真の単一分子実験（ すなわち 、1つを使用して、全実験期間にわたって同じプローブ分子）を有するプローブ分子は、AFMチップに共有結合されるべきである。ここで、共有結合を介して単一分子カンチレバーの官能化のための実験プロトコルが提示される。単一分子は、アミノまたはチオ介して結合することができるいずれかAFMチップのL群。コンジュゲーションプロセスは、使用されるポリマーの溶媒和特性を考慮して、溶剤（有機及び水性）広範な種類の中で行うことができる。 最初の部分では、共有結合的にAFMチップを、リンカー分子を介して単一分子（「プローブ分子」）を取り付けるための一般的なプロトコールが記載されている。この目的のために、有機NHS-またはマレイミド化学を13に使用される。 3つの例示的分子のためのプロトコルと共に、データ収集及びデータ解析プロセスが記載され、さらに読み出し用の参照が提供される。例分子である：（リニア）ポリマーチロシン、グラフトポリマーPI-G -PSおよび脂質POPE。これは共有結合システインを添付する例えば、プロトコルのわずかな変動が含まれています。また、セクションは、そのようなダイヤモンド表面、CH 3 -self組織化単分子膜と脂質二重層として異なる面の準備に専念しています。これらのインタフェースは、箴を持っているEN良い参照と例であることを。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry acetone (&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry chloroform (&gt; 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (&gt;&amp;nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &amp;alpha;-methoxy-&amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;methyl-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;,&amp;omega;-bis-NHS PEG, 6&amp;nbsp;kDa, &amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;-maleimidohexanoic- &amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule (polymer, lipid, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10&amp;nbsp;ml), glass Petri dishes (500 &amp;micro;l) and glass lids</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratory oven model UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled sonicator</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma system &quot;Femto&quot;, 100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One separate glass syringe for each organic solvent</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l and 100-1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM with temperature controlled fluid cell (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MFP-3D with BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

原子間力分光法は、表面や界面での分子を研究する理想的なツールです。共有結合的にAFMチップ上に結合する単一分子の多種多様の実験プロトコルが提示される。同時に、AFMチップはAFMチップに結合した単一の分子を研究するための前提条件でチップと基板との間の非特異的相互作用を防止するために不動態化される。固体表面にバイオインターフェイス上の接着力、密着長さ、およびこれらの分子の自由エネルギーを決定するための分析がすぐに提示され、さらに読み出し用の外部参照が提供される。例分子は、ポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE（1-パルミトイル-2- oleoyl- のsn -glycero -3-ホスホエタノールアミン）である。これらの分子は、CH 3 -SAMsのような異なる表面、水素終端ダイヤモンドから脱着や各種溶剤条件下における脂質二重層をサポートされています。最後に、力分光法の利点は、単一分子実験は真に単一分子実験で研究されているかどうかを決定するための手段を含む、議論されている。

以下では、上記の結果は、例えば分子 ​​、すなわちポリマーのポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE記載、提示されている。まず、各実施例について、データ収集及びデータ準備のための試し特定の詳細が提供される。その後、これらの分子は異なる表面から脱着された実験用の例示的な結果（CH 3 -SAMs、水素終端ダイヤモンドと脂...

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K ビュー.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

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Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

コロイドプローブナノスを使用して、粒子間相互作用の定量的および定性的調査

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

化学

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

生物工学

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

生化学

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

工学

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

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