私たちは支援のためCIBIO（トレント大学）とCNR神経科学研究所の管理スタッフに感謝したいと思います。ジョバンニProvenzanoはFondazione Veronesi（ミラノ、イタリア）からのポスドクフェローシップでサポートされています。この作品は、イタリアの大学研究省（PRIN 2008グラント＃YBに200894SYW2_002とPRIN 2010年から2011年のグラント＃2010N8PBAA_002）、トレント大学（YBにCIBIO起動グラント）とテレソン財団（へグラント＃のGGP13034によって賄われていましたYB）。

全ての実験は、欧州共同体指令63分の2010 / EUに準拠して行われた、健康のイタリアの省によって承認されました。 1.動物実験、住宅と治療<ol><li>各機関動物ケアのガイドラインに従ってマウスを使用して、すべての実験のプロトコルを実行します。 </li><li>食料と水自由摂取させ 、12時間の明/暗サイクルの動物を維持します。 </li><li>ハウス2-4の群のマウスには、おがくずや寝具材料と標準サイズのポリカーボネート製マウスケージに毎週変更しました。 </li><li>疾患に対する感受性は神経発達障害の異なるマウスモデルにおいて、年齢や性別に応じて変化することができるので、年齢と性別をマッチさせたマウスを使用してください。 </li><li>統計的有意性（免疫組織化学実験のための行動の研究と遺伝子型ごとに4匹のマウスについての遺伝子型あたり10匹のマウスの最小）に達するまで、動物の適切な数を選択してください。 </li></ol> 2.モリス水迷路（MWM） <ol><li>円形タンク（直径100センチメートル、高さ50センチメートル）を使用します。 <ol><li>タンク周りの部屋のディバイダーにいくつかの視覚的な手がかりを置き​​ます。 </li><li> 4架空の象限のうちの一つの中心にある固定位置にタンクに直径10cmのプラットフォームを配置します。すべてのトレーニングセッション全体のすべての試験について同じ象限内に隠されたプラットフォームをしてください。 </li><li>プラットフォームは水の表面の上1cmであるまで、水道水でプールを入力します。平衡化する水の温度は22℃に近くなければなりません。このステップは数時間かかることがあります。水の温度を平衡化するために必要な時間を短縮するお湯を加えます。 </li><li>水を不透明にするために白、非毒性塗料の約1.5〜2 Lを追加します。 </li></ol></li><li>トラックの取得手順<ol><li>標準のCCDカメラやビデオボードとMWMの追跡システムを設定します。このようなパスの長さのようないくつかの変数を監視し、分析するために、ビデオ·トラッキング·システムを選択して、ESCAPEの遅延、および時間は、各象限に費やされました。 </li><li> 4つの象限にアリーナを分割し、ライブトラッキングのための動物と背景との間の最適なコントラストを確保するために、検出設定を調整します。 </li><li>プラットフォーム領域を指定します。 </li><li> 60秒、最大試行時間を設定します。 </li></ol></li><li> MWMテスト<ol><li>行動試験の前に、マウスに彼らはプールや空間キューを見ることができない領域で20〜25分間の適応期間を可能にします。 </li><li> （それらの間に20〜30分間隔で2回連続の試験日）9日間各マウスを訓練します。 </li><li>パソコンとカメラに切り替え、ビデオ追跡システムソフトウェアを起動します。 </li><li>その頭は、4つの開始位置（北、南、東、西）のいずれかから開始し、プールの側に指摘して、その尾によってマウスを取り、水の中に配置します。各マウスについて、開始位置は異なり、試験全体でpseudorandomizedでなければなりません。 </li><li>マウスが泳いでみようとplatfを検索60秒の最大のためのORM。動物がプラットフォームに到達すると、それは20秒間プラットフォームに滞在することを可能にします。 </li><li>マウスがその時間内にプラットフォームを見つけることができなかった場合は、ゆっくりその尾をつかんでプラットフォームにマウスを案内し、それが20秒のためにそこに滞在してみましょう。動物はすべて2つの試験を完了した後、タオルでそれを乾燥させ、ケージに戻します。 </li><li>訓練期間のそれぞれの日は、同じ手順（手順を2.3.4-2.3.6）繰り返します。 </li><li>最後のトレーニングトレイルの後9日目に、プローブテストを実行します。 </li><li>プールからプラットフォームを削除します。 </li><li>マウスが泳いでみようと60秒の最大のためのプラットフォームを検索します。 </li><li>定期的に、それは同じ（22°C）であるべきであるように、水の温度をチェックし、プールを一掃。 </li></ol></li></ol>灌流動物からの切片の調製<ol><li> MWMの最後にマウスを生け贄に捧げます。遺伝子型あたり4匹のマウスをeuthanizの前に麻酔されなければなりませんローカルおよび国際的なガイドラインに従ってエーション。 </li><li> 10-15 PBS中の4％パラホルムアルデヒド、続いて4-5分間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で（出血を可能にし、灌流するために左心室に蝶のカニューレを導入するシザーauriclewith権利をカット）経動物を灌流22分。 </li><li>解剖し、少なくとも12時間、4℃で4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 </li><li>スライスのために必要とされるまで4℃で0.1 M PBSおよびストア内の0.02％アジ化ナトリウムを15 mlを含む50ミリリットルポリスチレンコニカルチューブに脳を置きます。 </li><li>ビブラ切断前に小脳をカットし、削除します。 </li><li>ビブラのホルダープレート上に、瞬間接着剤を使用して、切断部位で脳を直立接着。 </li><li>適切なビブラトームに、背側海馬を通してシリアルために、20〜40ミクロ​​ン厚の冠状切片に脳をカット。 </li><li>ペイントブラシでビブラトーム切片を収集し、2に転送各ウェルについて、0.1MのPBS 1 mlを含む4マルチウェルプレート。 </li><li> 4ºCで、PBS中の0.02％アジ化ナトリウムで、PBS中の短期または長期のためのショップのセクションでは、（組織には、最大1年間に使用されるかもしれません）。 </li></ol> 4.免疫組織化学<ol><li>各ウェルについて、0.1MのPBSを500μlを含む24マルチウェルプレートに転送3-5各マウスについて、背側海馬のセクションでは、。 </li><li> 0.1 M PBS（穏やかに振盪しながら5分間、3回）の500μlの各ウェルに含まれるセクションを洗ってください。 </li><li>穏やかに攪拌しながら20分間、PBS中の1％H 2 O 2のセクションをインキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li>組織の透過性：PBS中の0.2％トリトンX-100で5分間のセクションをインキュベートします。 </li><li>上記の手順（4.4; 4.5）の間に、（numbe全実験のための十分なブロッキング緩衝液（PBS中10％ヤギ血清および0.1％トリトンX100）を作りますセクションのR×100μL×3段階）。 </li><li>注：（ビオチンに結合）二次抗体が作られたのと同じ種から使用血清を。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温（RT）で1時間バッファー（100μL/セクション）をブロック内のセクションをインキュベートすることによって非特異的抗体の結合を防ぎます。 </li><li>穏やかに撹拌しながら、4℃で一晩、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体（のpERK）のセクションをインキュベートします。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温で1時間（ステップ4.6で使用したものと同じ）を、ブロッキング緩衝液中に希釈したビオチン（250 1）とコンジュゲート二次抗体でインキュベートします。 </li><li>アビジンとビオチン複合体に室温で少なくとも30分を必要とするため、同時にABC試薬を準備します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってABC試薬の必要量を準備します。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li> IncubatABC試薬で室温で45分間のEセクション。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li> DABは発癌性や催奇形性であるとしてDAB作業溶液を調製し、DABを含むすべてのステップは、ドラフト内で行う必要があります。 </li><li>プラスチック転送ピペットで新しいプレートにDAB溶液を移します。 </li><li>手でDAB作業溶液にゆっくりと旋回プレートを含むプレートに置いてセクション、セクションの最大エクスポージャーを可能にします。 </li><li>適切な信号が発生するまで、顕微鏡のDAB反応（2-5分）を監視します。 </li><li> 0.1 M PBS（3×5分）で組織を洗浄することにより、所望の色の強さで反応を停止します。 </li><li>一晩換気フード内の残りのDAB基質溶液を不活性化し、実験室でのガイドラインに従ってこれを処分する漂白剤を使用してください。 </li><li>ゼラチンのマウント切片をPBSに浮遊させることによって、スライドをコーティングしました。次いで、室温で少なくとも3〜4時間でそれらを乾燥させます。 </li><li> 50％、70％、95％で連続切片を脱水100％の2分毎エタノール、および5分間、100％キシレン中で明確。 </li><li>マウンティング培地を用いてカバースリップし、一晩乾燥さヒュームフードのままにしておきます。 </li></ol> 5.セル数<ol><li>カウントのpERK陽性細胞は、背側海馬のレベルで三から五の項では、動物ごとに分析する必要があります。 </li><li>適切な顕微鏡を用いて200倍の倍率で各セクションからの複数の明視野画像を取得し、その後、画像処理ソフトウェアを使用して組み立てます。 </li><li> ImageJのフリーソフトウェアを使用して、TIFF-変換モザイク画像上の細胞数を実行します。 </li><li> 100×100μmの各2〜3カウントボックスの上に門と顆粒細胞層中のpERK染色細胞をカウントします。 </li><li>細胞密度は、ウィンドウをカウント当たりの標識細胞の数（100×100ミクロン）と表現します。 </li><li>遺伝子型の間に有意差を評価するために統計分析を実行します。これは、スチューデントのtを用いて達成することができます試験またはANOVAは、市販のソフトウェアを使用して、適切な事後検定を行いました。 P &lt;0.05で統計的有意性レベルを設定します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません

- / -マウス、神経発達障害のマウスモデルここでは、たEn2でMWM後の神経活性化を明らかにするためのpERKの免疫組織化学プロトコルを提供します。 - / - WTと比較して変異体たEn2のCA3サブフィールドで検出されたのpERKのレベルを減少させました。異なるCA3サブフィールド、のpERK陽性ニューロンの一般的な増加で観察されたものからではなく、両方の門で検出されたとEN2のGCL ...

神経発達障害は、中枢神経系（CNS）の開発および成熟が中に早期に乱されたダウン症候群、脆弱X症候群（FXS）、レット症候群、神経線維腫症、結節性硬化症やASD、などの障害の広い異種基などが挙げられます出生前の期間1。これらの発達脳機能障害は、運動機能、言語、学習と記憶のプロセスに深刻な、生涯影響を引き起こす可能性があります。遺伝的要因と環境要因の過多は、ここ数年の間に2,3神経発達障害の病因に関与しています。臨床表現型の根底にある分子メカニズムは不明のままであっても、上記の知見は、これらの障害のいくつかのマウスモデルの開発を可能にしています。学習および記憶障害には、TSC1 +/-、TSC2 +/-としてこれらのマウスモデルの数が特定されています、NF1 +/-と EN2 - / -マウス2,4-7。神経発達障害の分野における重要な課題は、記憶や学習障害の基礎となる細胞および分子プロセスの同定です。学習または記憶の間に活性化、選択のシグナル伝達経路は、特定の遺伝子の転写を誘導し、最終的にデノボのタンパク質合成につながることができます。即時初期遺伝子（IEGs）の活性化およびタンパク質依存性シナプス修飾は、急速に神経活動と行動訓練8,9に応じて脳の神経細胞に誘導されます。 ニューロフィブロミンを含むシグナル伝達経路の欠損は神経発達障害における学習障害と関連しています。ニューロフィブロミンは、変異神経線維腫症1型の原因となるNF1遺伝子、神経系腫瘍によって特徴付けられる複雑な遺伝性症候群、行動、モータ遅延、および認知DISAの製品ですbilities 10。抑制性ニューロンに制限NF1欠失についてヘテロ接合マウスは、長期増強（LTP）の初期段階だけでなく、MWM 5,11,12、侵入した空間学習の欠損を示します。興味深いことに、このマウスモデルにおけるNF1欠損が増加ERKのリン酸化、最終的にこれらのニューロン5からのGABA放出の異常な増強を生じ、学習の間に介在阻害におけるRASシグナリングの過剰活性化をもたらします。 これらの知見に基づいて、行動タスク後の神経活動の可視化は、神経疾患に関与する特定の回路を再構成する方法を示しています。ここで説明する免疫組織化学プロトコルは、認知障害とASDマウスモデルにおいてMWMを次の海馬ERKリン酸化レベルを評価し、定量化することを目指しています。 MWMは広くげっ歯類13,14に海馬依存空間学習および記憶を調べるために使用され</s&gt;アップ。我々は、ERKは、学習と記憶形成の15において重要な役割を有することが示されたため、タスク依存海馬学習の分子読み出しとしてERKリン酸化を使用することを決定しました。また、ERK経路は、開発視覚野16における経験依存的可塑性のために必要です。最後に、CNSショーで2 ERKアイソフォーム（ERK2）のいずれかを欠損したマウスは、ERKシグナルは、ASDなどの神経発達障害の病因に重要な役割を果たしている可能性があることを示し、認知感情的、社会的行動17の異常をマーク。 神経発達障害のモデルとしてマウス（ - / -たEn2）私たちは、エングレイルド2ノックアウトを使用していました。 EN2 - / -マウスは、前脳の介在18の損失を含む解剖学的および行動「ASD様」機能では、ASD関連遺伝子19の発現低下を示し、社交性を減少し、損なわれた認知の柔軟性6,7,20。空間learni- / -マウス6,7および21 ASD患者で観察された認知機能障害に関連する可能性があるようなMWMで検出されたものとしてNGとメモリの欠陥は、たEn2、特に堅牢です。 - / -成体マウス7さらに、我々は、MWMにおける減損空間学習が減少ニューロフィブロミンの発現に関連するとEN2の門でのpERKレベルを増加させることが示されました。ここでは、このASDマウスモデルにおいてMWMを次のpERKの免疫組織化学的特性評価のための詳細なプロトコールを提示します。

<table><tbody><tr><td>EthoVision XT 8</td><td>Noldus Information Technology</td><td></td><td>This software platform is not a requirement &amp;ndash; there are many other behavioral softwares on the market.</td></tr><tr><td>Tempera Paint</td><td>Giotto - Fila Group Company</td><td></td><td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Equivalent models from other companies can be used.</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Sigma</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>66004-950</td><td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S2002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Abcam</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ABC kit Vectastain&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td></tr><tr><td>DAB peroxidase substrate</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Add in a volume of 5 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and mix.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>pERK antibody</td><td>Cell Signaling Technologies&amp;nbsp;</td><td>4370</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&amp;nbsp;</td><td>Dilution 1:250</td></tr><tr><td>SuperFrost Slides&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>317616</td><td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>&amp;nbsp;Zeiss&amp;nbsp;</td><td>Axio Imager.M2</td><td>Equivalent microscope can be used.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>To assemble images.</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat Software Inc. (USA)</td><td></td><td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td><td></td><td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td></tr></tbody></table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

リン酸化され、細胞外調節キナーゼ（のpERK）の誘導は、学習に依存する神経活動の信頼性の分子読み出しです。ここでは、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するためのpERK免疫組織化学プロトコルを記述します。マウス、自閉症スペクトラム障害（ASD）のモデル具体的には、エングレイルド-2ノックアウト（ - / -たEn2）におけるモリス水迷路（MWM、古典的海馬依存性学習課題）後の神経の活性化を研究するためのpERK免疫染色を使用していました。野生型（WT）対照と比較して、たEn2 - / -マウスは、MWMにおける重要な空間的学習障害を示しました。 WT動物と比較して、マウス- / - MWM後、pERKの陽性ニューロンの数の有意差は、特定の海馬たEn2のサブフィールドで検出されました。したがって、我々のプロトコルは、ロバストの違いを検出することができますASDのマウスモデルにおいて、海馬依存性学習障害に関連付けられているのpERK陽性ニューロン。より一般的には、我々のプロトコルは、認知障害の両方により特徴づけられる遺伝的または薬理学的なマウスモデルにおいて、海馬ニューロンの活性化のプロファイルを調査するために適用することができます。

ここで説明するプロトコルは、免疫組織化学により、可視化するために設計された、神経発達障害のマウスモデルにおいて、MWM後の海馬ニューロン活動の特定のマーカーの発現。ここに示したすべての実験データは、我々の最近の仕事7から採取しました。男性と女性のWTとEN2 - / - （3-5ヶ月齢;重量= 25〜35グラム）年齢をマッチさせた大人の同腹子ヘテロ接合交配から得られた?...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K ビュー.  University of Trento. 我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。 

ビデオ: Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

行動学

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

神経科学

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using interneurons to replace or mitigate the effects of altered neuronal circuits is an attractive therapeutic avenue. To this end, more knowledge is needed about how human stem cell-derived GABAergic interneuron-like cells (hdINs) mature, integrate, and function over time in the host circuitry. Of particular importance in neurodevelopmental disorders is a better understanding of whether these processes in transplanted cells are affected by an evolving and maturing host brain. The present protocol describes a fast and highly efficient generation of hdINs from human embryonic stem cells based on the transgenic expression of the transcription factors Ascl1 and Dlx2. These neuronal precursors are transplanted unilaterally, after 7 days in vitro, to the hippocampus of neonatal 2-day-old mice. The transplanted neurons disperse in the ipsi- and contralateral hippocampus of a mouse model of cortical dysplasia-focal epilepsy syndrome and survive for up to 9 months after transplantation. This approach allows for investigating the cellular identity, integration, functionality, and therapeutic potential of transplanted interneurons over an extended time in developing healthy and diseased brains.

Transplantation of human pluripotent stem cell-derived GABAergic neurons generated by neuronal programming could be a potential treatment approach for neurodevelopmental disorders. This protocol describes the generation and transplantation of human stem cell-derived GABAergic neuronal precursors into the brains of neonatal mice, allowing long-term investigation of grafted neurons and evaluation of their therapeutic potential.

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using ...

Imaging Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

<a href='https://app.jove.com/v/52919/immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after'>Source: Provenzano, G., et al.&#160;Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp.&#160;(2015)</a>This video demonstrates immunohistochemical imaging to visualize hippocampal neuronal activation. Stained brain sections reveal darker regions under a bright-field microscope, indicating activated neurons.

Source: Provenzano, G., et al.&#160;Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Structural & Functional Brain Imaging

Fluorescence Immunostaining of Rat Hippocampal Neurons within a Microfluidic Chip

Source: Nagendran, T., et al., <a href="https://app.jove.com/v/58421">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates immunofluorescence staining of rat hippocampal neurons cultured within a microfluidic chip to analyze neuronal maturation and connectivity.

マイクロ流体チップ内のラット海馬ニューロンの蛍光免疫染色

1. Fluorescence Immunostaining within the Chip

	Prepare 4% formaldehyde fixation solution in PBS (4% formaldehyde, 1 &#181;M MgCl2, 0.1 &#181;m CaCl2, ...

Neuropathology

Trauma

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

	...

Developmental and Pediatric Disorders

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

<a href='https://app.jove.com/v/56153/evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices'>Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).</a>This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic architecture through their colocalization.

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for ...

Synaptic & Cellular Imaging

An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis

Source: Ansorg, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52551">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2015)
The video illustrates an immunofluorescence staining method used to examine neurogenesis in the adult hippocampus. Initially, a mouse brain section undergoes treatment with primary antibodies directed at marker proteins associated with neurogenesis in neuronal progenitor cells. Next, it is labeled with secondary antibodies tagged with fluorophores. The brain section is then observed under a confocal microscope to distinguish various subtypes of progenitor cells, based on the expression patterns of distinct combinations of marker proteins.

成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Tissue ...

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

要約

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この動画の章

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

インビボマウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

Imaging Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

マイクロ流体チップ内のラット海馬ニューロンの蛍光免疫染色

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

要約

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生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

Imaging Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

マイクロ流体チップ内のラット海馬ニューロンの蛍光免疫染色

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

インビボマウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング