この作品は、助成金番号EPS-0903795国立科学財団、NIH NIDCR R01-DE019355（MJY PI）、及びグラント8P20 GM103444（YM PI）によって授与の下で政府の支援によってサポートされていました。

アルギン酸ハイドロゲルの三次元Bioprintingのための基質を含むゼラチンの調製<ol><li>高いコンテンツに関連する減少した生存可能性を回避するためにPataky ら 11により記載のカルシウム/ゼラチン基質法以下のカルシウム/ゼラチン基板を準備します。カルシウム/ゼラチン基質法は、以下に記載されています。 <ol><li>塩化カルシウム水和物（1.5重量％）、塩化ナトリウム（0.9重量％）、およびブタゼラチン（2重量％）を蒸留水に結合し、100mMのゼラチン溶液を作成し、2分間沸騰させます。 </li></ol></li><li> （少なくとも8をゲル化することを可能にする100ミリメートルにゼラチン/カルシウム溶液5mlを入れ標準ペトリ皿で​​も、表面にコーティングするために周りのソリューションを旋回し、ゲル、O / Nに冷蔵庫で平らな面に置き使用前に時間）。 </li><li>基板表面の不透明度を高めるために、ゼラチン/ 塩化カルシウム溶液に二酸化チタン（0.3重量％）を加えます。 10分間攪拌します。 AUTそれを滅菌するために30分間液体サイクル上のゼラチン/ TiO 2のソリューションをoclave。 <ol><li>先に調製したゼラチンプレートの表面にゼラチン/ TiO 2の溶液3mlを追加します。それが表面に均一に広がっていることを確認するために、混合物を渦巻。 （使用前に少なくとも8時間をゲル化することを可能にする）4℃の冷蔵庫のO / Nでゲル化することができます。基板は、3日以内に使用しなければなりません。 </li></ol></li></ol> 2.アルギン酸酸化<ol><li>以下で説明するBouhadir ら 30によって部分的に酸化されたアルギン酸塩のための方法以下のアルギン酸ナトリウムbioinkを酸化します。 <ol><li> 5％酸化アルギネート溶液を作るために、100mlの蒸留水にアルギン酸ナトリウム1gを溶解します。 5％の酸化溶液を生成するために、過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液（0.25 M、0.25 mmol）を、酸化剤を加えます。室温で19時間撹拌します。 REAを終了するために24時間後の溶液に40 mlのエチレングリコールを追加ction。 </li><li>溶液中の塩化ナトリウムを2.5g溶解します。酸化されたアルギン酸塩を沈殿させるために：（1比2）エチルアルコールの過剰量を追加します。沈殿物を収集するために千×gで遠心分離し、溶液を蒸留水で再溶解します。エタノール洗浄を繰り返します。 </li><li>凍結乾燥使用するまで-20℃で酸化アルギン酸ペレットと店を。 </li></ol></li><li>ナトリウムの割合を測定することにより、酸化の程度を決定するエチレングリコールによって終了される前に消費素酸。 <ol><li>ヨウ化カリウム溶液（w / vの20％、pH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液）およびthyodene溶液（w / vの10％、pH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液）を準備します。室温で酸化アルギン酸を持つ2つの溶液を混合。 </li><li>徐々にヨウ化カリウムとtheodyne溶液の混合物に反応させ、アルギン酸ナトリウム素酸水溶液をドロップします。 426 nmで分光光度法、混合物の吸光度を測定します。それが到達したときに最大値は、V 1としてアルギン酸塩及び過ヨウ素酸ナトリウム溶液を使用量を記録します。 </li><li>反応があります<img alt="式（1）" fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" /> 。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムの量は、 <img alt="式1.5" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" /></li><li>過ヨウ素酸ナトリウムの消費量を決定するために、元の濃度から未反応の過ヨウ素酸ナトリウムの量を差し引きます。前の式を使用して、アルギン酸塩の最終的な酸化度を決定します。 </li></ol></li></ol> 3.アルギン酸ペプチドコンジュゲート<ol><li>ローリーら 31により、RGD-アルギン酸結合方法に従うことにより、先に調製した酸化アルギン酸塩にさらさアルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列（ペプチド）との結合体のリガンドは、細胞の付着および拡散を促進するために、以下に説明。 </li><li>水carbodを使用してくださいG 4 RGDSPto複合体31とiimide相性。 </li><li> 0.1 M 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液中の5％の酸化アルギナート1gを溶解し、pHが4 = 1-エチル - （ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC、0.54ミリモル）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（追加します2のNHS、0.27ミリモル）：1の比率は、アミド中間体を形成します。 </li><li>末端アミンを介しアルギン酸塩ポリマーの主鎖に結合させる、0.28ミリモルペプチドを追加します。 RT O / Nで撹拌。 </li><li>この溶液に2.5グラムの塩化ナトリウムを添加することにより、カップリング反応を停止させます。酸化されたアルギン酸塩を沈殿させるために：（1比2）エチルアルコールの過剰量を追加します。沈殿物を収集するために5分間4,000×gで、混合物を遠心。細胞培養フード内でメディアを吸引し、蒸留水で沈殿物を再溶解します。エタノール洗浄を繰り返します。 </li><li>後で（白色粉末状物質として表示されます）、それが完全に乾燥するまで沈殿物を乾燥、凍結とCの冷蔵庫°-20で店使用しています。 </li></ol> 4.ヒト脂肪組織の間質細胞（hADSCの）細胞培養<ol><li>培養ヒト脂肪組織間質細胞（hADSCの）10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％グルタミン、および1％のアンチマイシンで15 mlの低グルコースDMEMで覆われた細胞培養フラスコ（T75フラスコ）で処理した75センチメートルです。彼らはコンフルエント（80〜90％）に到達するまで、2日ごとに、細胞培養フード内で、メディアを変更します。 </li><li>集密したら、細胞培養フードにT75フラスコを転送し、トリプシン酵素消化法を用いhADSCのを中断する。 <ol><li>フードでは、細胞からの細胞培養培地の全てを吸引します。カルシウムとマグネシウムとのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS ++）5mlで洗浄します。細胞のオフDPBS ++を吸引します。 </li><li>フード内が、1ミリリットルトリプシンおよび4ミリリットルのDPBS ++を混合することにより、トリプシンおよびDPBS ++のソリューションとなります。各フラスコをsolutの5ミリリットルを必要としますイオンは、そのようにコンフルエントなフラスコの数の適切なボリュームを作ります。各フラスコにトリプシン/ D​​PBS ++の5ミリリットルを加え、2分間インキュベーターに入れて。 </li><li> 2分後、フラスコを取り除き、軽く底から細胞を緩めるために、それらの側面をタップします。細胞が中断されることを保証するために、顕微鏡下で各フラスコを見てください。バック細胞培養フード内でフラスコを置き、各フラスコに、適切な細胞培養培地の3ミリリットルを追加します。これは、トリプシン反応を終了します。 </li><li>各フラスコから細胞を含んだメディアを転送し、50mlの円錐に入れます。 5分1,000×gで、それらを遠心。細胞は、円錐の底に小さな白いペレットとして表示されます。バック細胞培養フードに移し、メディアを吸引除去します。細胞培養培地2mlに細胞を再懸濁。 </li><li>顕微鏡下で血球計数器を用いて細胞を数えます。細胞は培養フードで、カウントされた後、アリコート〜1.3 millioを含む培地の量n個の細胞、15 mLコニカルに移します。遠心千×gで5分間、再び細胞を含む15 mlのコニカル。 </li><li>培養フードでは、各フラスコに〜35万細胞の濃度を追加して、複数のT-75フラスコ内の残りのセルを再シード。 DMEM培地の15ミリリットルを追加して、再度コンフルエントになるまで培養器に戻します。 </li><li>遠心分離サイクルが完了すると、細胞培養物に15 mlの円錐を返します。吸引し、細胞ペレットからのメディア、およびbioinkを通して細胞の均一な分布があるので、多くの場合、解決策をterteriating、bioink 1ミリリットル当たり130万個の細胞の濃度で水性アルギン酸塩溶液で細胞を再懸濁します。無菌プリンタ互換の3ミリリットルシリンジに細胞を含んだソリューションをロードし、滅菌した22 Gプラスチック先端にネジ止めします。 </li></ol></li></ol> 5. Bioprinterセットアップ<ol><li> bioprinter、ディスペンサーの各コンピュータ、およびrecirculatをオンにします水浴をる。 <ol><li>手動でゲル化機構のために再循環水浴温度を設定します。 </li><li>手動相関ディスペンサーコンピュータ上の各ディスペンサー用の印刷パラメータを設定します。 230 NL、0にバックステップ数、-sec10μLするの分配率に分注容量を設定します。 </li></ol></li><li>設計ソフトウェアとコンピュータのUSBカメラのディスプレイを表示するためのプログラムを開きます。 <ol><li>ソフトウェアを使用して、手動で液滴間の2.4ミリメートル間隔で5×5ドットアレイの座標を入力します。 </li><li>なるように印刷パラメータを設定します。先端と基板表面との距離= 0.1ミリメートル;高さの注射器は、堆積の間に持ち上げられる= 20ミリメートル; = 1秒あたりの堆積時間。 </li><li>プログラムを保存して、ロボットに送信します。 </li></ol></li><li> 4°Cプリンタのステージ上でのゼラチン/ TiO 2を含有するペトリ皿を置きます。閉じて、室のドアをロックします。 </li><li> INIにPLCを使用してください紫外線光源をtialize、90秒間チャンバを殺菌。 </li><li>滅菌が完了したら、チャンバーを開き、hADSCの銃にアルギン酸に懸濁1.クローズを含む注射器をロードし、室のドアをロックします。 </li><li>平衡内圧のために30秒を待って、ファンシステムをオンにするために、PLCを使用してください。 </li><li>コンピュータでは、幾何学的な経路及び印刷パラメータを含むプログラムを実行します。 </li><li>印刷プロセスを通して、正確で均一な印刷を確認するために、コンピュータにUSBカメラのディスプレイを見ます。 </li><li>印刷が終了したら、構築物は、40分間、ゲル化することを可能にします。 </li></ol> 6.細胞生存率の評価<ol><li> DMEM中ですぐに印刷後画像形成されるようになっていない構造体を覆い、撮影時まで、インキュベーター内で保管してください。 </li><li>構築物の生存度を定量するために、蛍光ベースの生存性/細胞毒性アッセイを使用して染色し、共焦点顕微鏡を用いて目の画像。 <ol><li>キットの指示に従って、カルセインAMおよびエチジウムホモダイマー1を含む染色液を準備します。 、染色溶液10mlを行い、エチジウムホモダイマー120μlのカルセインの5μLを追加するには、無菌の10mlまで午前、組織培養グレードのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（+マグネシウム+カルシウム; DPBS ++）。 </li><li>暗所で15分間染色液でbioprinted構成体を浸し。 </li><li>画像0日と8で共焦点顕微鏡システムを用いて染色構築物は、300ミクロンの深さで30光学スライスのZスタックパラメータを使用して、各bioprintedコンストラクトの複数の写真を撮ると、手動で細胞をカウントします。細胞は、黄色または緑色の表示された場合などの生きているそれらをカウントし、赤の場合には、死んだとして、それらを数えます。 </li></ol></li><li>構築物中の細胞の総数で割った生細胞の数と細胞生存率のパーセンテージを計算。の細胞生存率=数生細胞（緑+黄色）/総細胞数（緑+赤+黄色）×100％。 </li><li> 8日目の細胞数は、0日目に、細胞数で除し、各サンプルについての細胞増殖の量を計算します。 8日目/生細胞の細胞増殖=生細胞数日の0×100％にカウントします。 </li></ol> 7. RGDペプチドコンジュゲートの分析<ol><li>アルギン酸のRGDペプチド結合の成功を分析するために、RGD共役アルギン酸塩と非共役アルギン酸塩を比較します。これを行うため、画像印刷（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）（DAPI）を用いて構築し、ファロイジン染色。 <ol><li> DPBS ++200μlのメタノール原液の5μLを希釈して使用液をphalloidinsを行います。使用するまで-20℃で保存してください。 </li><li> （0.10509グラム/ L）/（350.3グラム/モル）= 3×10 -4 M = 0.0003 M = 0.300ミリモル= 300μM：以下の式DAPI染色の300μMのストック溶液を作ります。目を作ります3μM溶液を得たDPBS ++で100：原液1を希釈することにより、電子のDAPI作業溶液。使用するまで-20℃で保存してください。 </li></ol></li><li>完全に4％パラホルムアルデヒドでサンプルを沈めます。室温で1時間インキュベートします。溶液を5分間ずつ洗浄静置し、DPBS ++で3回洗浄します。プロセス中のゲルを裏返し、スライドガラスによくからゲルサンプルを転送します。 10分間、DPBS ++中の0.1％トリトンX-100中でゲル（0.1グラム/ 100ml）に浸します。各洗浄のために5分を可能にすること、DPBS ++で3回洗浄します。 </li><li>作動溶液中に浸漬することによってファロイジンを有するプリント構築物を染色します。ホイルで覆い、4時間インキュベートします。ファロイジン染色を取り外し、DPBS ++で3回洗浄します。最初の洗浄は、後者の洗浄は5分ごとに座るべきで、高速である必要があります。 </li><li> DAPIワーキング溶液中に浸漬することによって、DAPIを備えたプリント構造物を染色します。ホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。ウォッシュ各洗浄を5分間静置しDPBS ++で3回。共焦点顕微鏡システム上のサンプルを観察し、画像。 </li></ol>

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H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Partially+Oxidized+Alginate+and+its+Potential+Application+for+Tissue+Engineering.">Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering.</a> Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).</li><li>Rowley, J. A., Madlambaya, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+Hydrogels+as+Synthetic+Extracellular+Matrix+Materials.">Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li><li>Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Environmental+Factors+that+Impact+Viability+of+Tissue&#8211;Engineered+Constructs+Fabricated+by+a+Direct&#8211;Write+Bioassembly+Tool.">Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue&#8211;Engineered Constructs Fabricated by a Direct&#8211;Write Bioassembly Tool.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).</li><li>Ozbolat, I., Yu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Towards+Organ+Fabrication:+Challenges+and+Future+Trends.">Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).</li><li>Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Rapid+Prototyping+Techniques+for+Tissue+Engineering+Purposes.">A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes.</a> Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).</li><li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=25th+Anniversary+Article:+Engineering+Hydrogels+for+Biofabrication.">25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication.</a> Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+of+Tissues+and+Organs.">3D Bioprinting of Tissues and Organs.</a> Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Alginate+as+Bioink+for+Bioprinting.">Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).</li><li>Forty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Differential+Adhesion+Hypothesis:+a+Direct+Evaluation.">The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation.</a> Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).</li><li>Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+a+Biodegradable,+Covalently+Crosslinked+Shape&#8211;Memory+Alginate+Scaffold+for+Cell+and+Growth+Factor+Delivery.">Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape&#8211;Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery.</a> Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).</li><li>El&#8211;Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+Scaffolds+for+Tissue+Engineering:+Progress+and+Challenges.">Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges.</a> Global Cardiology Science, &amp; Practice. 3 (38), 316-342 (2013).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three&#8211;Dimensional+BioAssembly+Tool+for+Generating+Viable+Tissue-Engineered+Constructs.">Three&#8211;Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs.</a> Tissue Engineering. 10 (9&#8211;10), 1566-1576 (2004).</li><li>Ozbolat, I. T., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+&#8216;Multi-arm+Bioprinter&#8217;+for+Hybrid+Fabrication+of+Tissue+Engineering+Constructs.">Development of a &#8216;Multi-arm Bioprinter&#8217; for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs.</a> Robotics and Computer&#8211;Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).</li><li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Bioprinting+of+Vascularized,+Heterogeneous+Cell&#8211;Laden+Tissue+Constructs.+Adv+Mater.+X.">Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell&#8211;Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X.</a> Adv Mater. X, x-y (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

組織工学の主な焦点は、復元維持、または天然組織のfunctioを向上させることが可能な生物学的な代替を開発することによって、臓器不足や移植の必要性との間のギャップを埋めることです。これは、複合体と足場の直接製造、解剖学的に正しい外部ジオメトリ、および内部geometrを正確に制御するに至りました。三次元bioprintingはレイヤー・バイ・レイヤーapproacを用いてデジタルモデルから?...

組織工学は、維持、復元、または天然組織を強化し、機能するために代替の開発に生物学と工学の原則を使用しています。オンデマンドで三次元バイオミメティック構造体を生成する機能は、組織工学におけるならびに細胞ベースのセンサ、薬物/毒性スクリーニング、組織または腫瘍モデル、およびその他における科学技術の進歩を促進するであろう。それは密接に細胞と天然組織における細胞外マトリックスの高度に組織化された相互作用を模倣する必要があるため、組織工学構造物の三次元組織は、製造方法の基本的なコンポーネントです。 生分解性と形状形成三次元足場は、細胞が、細胞の二次元の層を形成するために移行するので、新規な組織構築物を生成する際に重要な要素であるが、好ま三次元で増殖する能力を欠いています。足場は、細胞の一時的な基盤として機能します添付ファイルおよび増殖するので、制御可能な多孔性および生分解性、および十分な機械的INTEGRITを有する材料から構成されなければなりません。足場材料は、細胞毒性であるか、またはホストからの有害反応を作成することはできません。ヒドロゲルは、一般に、組織工学技術において使用されており、それらの親水性のために、ヒドロゲルはstructurを通して流体及びガス交換を可能にします。異なるヒドロゲルを組み合わせることにより、合成されたハイドロゲルの特性は、異なるアプリケーションの要件を満たすために修正可能です。 従来の組織工学的手法は、細胞ポストfabricatioを播種する無細胞多孔質の犠牲足場の作成が含まれます。多くの技術は、ファイバ結合、溶媒キャスティングのように、使用され、溶融成形が、組織工学用途のための最低限の成功であることが証明されています。繊維結合方法は、繊維を特定の形状に整列されることを可能にするが、それらは、プロだけが可能です非常に薄い足場をducing。高度に多孔質構造体を製造し、ソルベントキャスト法では、しかし、最大の製造された膜はわずか3 mmのTHICました。このため、三次元構造を作成することは、これらの技術を用いて実現可能ではありません。溶融成形技術は、三次元足場を製造するのに成功したが、このような高温は、生物学的材料は、製造プロセスへ中に組み込むことができないことが要求されます。足場は、製造後の予め定義された又は制御可能な微細構造を有する三次元の足場を製造するために、組織工学の要件を満たす能力に制限されて播種し。固体足場播種技術のもう一つの大きな問題は、血管新生及び不十分な機械的の欠乏です。 Bioprinting以来、従来の欠点を克服するために、非毒性、生分解性、熱可逆性ゲルを使用して3次元に拡張されました。固体自由形状製造トン数現在採用されてechniquesは、レーザ支援bioprintingおよびインクジェット印刷されています。レーザ支援bioprinting技術は、三次元の生成するパルスレーザ源、ターゲットプレート、および受け基板を使用します。しかし、この技術は低いスループット、低い細胞生存率に制限され、唯一の光架橋性プレポリマーは架橋ヒドロゲルを形成するために使用することができるので、製造される構造だけの限られた配置を生成することができます。インクジェット印刷は、ピコリットルのインクを堆積させることによって、基板上にデジタル画像データを再生する非接触方法として開発されました。しかしながら、インクジェット印刷は、高解像度の構築物を生成しない、経験急速なタンパク質の変性を構築し、そして細胞の多くは、堆積中に溶解されます。 現在、新たな添加剤の製造bioprinting方法が開発されています。これらのシステムでは、細胞、タンパク質、成長因子、および生体模倣ヒドロゲルは、典型的には、マトリックスに組み込まれている母校IALS製造プロセス中に、同時に密接にネイティブのマイクロアーキテクチャを模倣する三次元骨格系の細胞を含んだ構築物を生成するために、コンピュータ制御のアクチュエータを使用して堆積されます。細胞を含んだヒドロゲルは、複数の細胞型、または均質からなる、不均質であることができるbioinkを構成します。添加剤の製造システム堆積bioink滴ずつx、y及びz方向に移動することができるコンピュータ制御ステージ上または層ごとの使い捨て注射器および先端経由。コンピュータソフトウェアを介して、印刷された足場のアーキテクチャは、容易にアプリケーションの要件に応じて操作することができます。従来の技術とは異なり、3次元医用技術（磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影​​法）は、患者特異的構築物を生成し、設計に組み込むことができます。構築物は、より高いLで製造されるため、これらの方法は、血管新生の置換を生成する可能性を可能にしますOCAL細胞密度、細胞 - 細胞相互作用を可能にし、移植後のsurvivaの可能性を向上させることができます。 パルメットプリンタは、三次元の異種の組織構築物（ 図1）を生成するためにプログラム可能なロボットの製造方法を使用して特注の三次元マルチディスペンサーシステムです。それは、ユニークな組み合わせで、複数の材料の使用は、不均質構造を生成することができます。 bioprinterの初期化は、それはあなたがbioprintedコンストラクトの印刷適性を最適化するために、様々なパラメータを設定することができますのでbioprintingの中で最も重要なステップの1つです。 bioprinterは、ユーザが対話式タッチスクリーン制御パネルを介して動作するプログラマブルロジックコントローラ（PLC）、（ 図1、A）で制御起動動作および停止配列とバッチ式プロセスを含みます。バイオの汚染を防止するために、論理材料bioprinterが正に加圧されたポリ（メチルメタクリレート）で囲まれた高効率粒子arrestance（HEPA）を有する（PMMA）チャンバは、空気循環システムを-filtered（ 図1、B、C）。プリンタの内部には、内蔵の紫外線光源（ 図1、D）を用いて滅菌することができます。 bioprinterの中心的なコンポーネントは、再現性10マイクロメートル（ 図1、E）の精度でディスペンサーチップを置くことができ、完全にプログラム可能な位置決めロボットです。ロータリースクリューを使用して230 NL（ 図1、F）のように、少量を堆積することができます3ディスペンサーがあります。彼らはそれぞれのディスペンサーのための印刷パラメータ（ 図1、G）を支配する別のコンピュータを使用して、独立してプログラム可能です。ロータリースクリュー分配は、注射器の下、シリンジ先端の外bioink移動するモータ駆動スクリューの回転を利用しています。これらのディスペンサーはpneumaticalに搭載されていますロボットは、ディスペンサーを切り替えることが可能LY制御ツールネスト（ 図2A、B）は 、プログラム制御下でZ軸ロボットアーム（ 図1、H）上に取り付けられています。 XYZロボットは設計ソフトウェア（ 図1、I）を実行しているコンピュータからの印刷指示を受けます。各プログラムは、分配場所、キャリブレーション・ルーチン、およびディスペンサー変化のプロトコルが含まれています。生成された構造物の設計は、主に、XYZから成り、各ディスペンサが材料を堆積する場所を調整します。 bioprinterシリンジ先端のXYZ座標を決定する2つの光の光センサ（ 図2C）を含みます 。これらのセンサは、ディスペンサー先端の位置を計算するためにこれらを使用してロボットに座標情報を送信します。 ACCURAで距離を測定するために30×100マイクロメートルのスポットサイズの633nmのダイオード赤色レーザ光 ​​を投射する追加の変位をレーザー（ 図2D）があります0.1マイクロメートルのCY。ビームが高度に集中した場合、ロボットは、印刷面のZ距離を決​​定します。この測定値、およびZにおける先端部の光学的光センサ測定値は、印刷面に関連してディスペンサー先端部を配置するために使用される正確なZ座標を計算することができます。分注チップは、X軸の中心を見つけるために、横方向にY軸センサを介してYとZの中心を見つけるために、X軸配向光学的光センサを介して横方向および垂直方向に移動し、。表面は、分配先端部の位置を基準にして場所を決定するために+ CZ = dで斧+：印刷面は、XYZ空間における平面の数式を使用してマッピングされています。プリンタステージ（ 図1、J）は 、直径80 mmのサンプルペトリ皿を保持し、設定温度（ 図1、K）を維持するために再循環水浴を使用しています。ステージ温度は、-20の範囲内に設定し、内部で安定したままこ​​とができます。 USBカメラを装着ありロボットZアームに印刷工程（ 図1、L）の間に分配チップの拡大図を提供します。印刷工程（ 図1、L）の間にbioprinterの完全なビューを提供し、チャンバ内部の上面に向けて取り付けられた第2のカメラがあります。 ソフトウェアを描画するコンピュータ支援設計は、堆積パターンを決定し、増分的に離間した液滴や複雑な構造（ 図3）を生成することを可能にします。三次元の経路を手動でプリンタと互換性のある設計ソフトウェアにコード化または別のコンピュータ支援設計図面ソフトウェア（ 図4、表1）からインポートすることができます。プリンタ対応のソフトウェアは、印刷、このような蒸着法（単一打滴または連続経路蒸着）などのパラメータ、経路の三次元形状、堆積速度、シリンジ先端との間の距離とSUBSTのバリエーションを可能にしますレート印刷面、個々のドロップ、および高さを堆積し、注射器を高速化するための時間の量は、液滴の堆積の間に持ち上げられます。各プログラムは、印刷時に、オペレータの介入なしに、無菌環境を提供するために、XYZ調剤場所、先端校正ルーチン、ディスペンサー変化のプロトコルが含まれています。ロボットのプログラマブル・ロジック・コントローラ（PLC）は、設計ソフトウェアを実行するコンピュータからの指示を受けて、外部コントローラ（例えば、ディスペンサー）からのイベントのタイミングを制御する。これを行うには、PLCは、ディスペンサーを制御するためにループ・メカニズムを使用して、ロボット位置決め装置、および環境要因。 三次元直接書き込みロータリースクリュー、液体分配システムを利用しbioprintingが堆積細胞の処理は、従来の方法よりも、効率的で正確、かつ容易にすることができます。本研究では、カスタム構築されたbioprinterは、CEを生成することが可能であることを示していますLLを含んだヒドロゲルは、高い細胞生存率を構築します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Positioning Robot (JR2000 XYZ)</td>
			<td>Janome&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Light Sensors:&#160;</td>
			<td>Keyensce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Displacement Laser: OD Mini</td>
			<td>SICK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Water Bath: Polystat</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-12122-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP</td>
			<td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td>
			<td>AD7013MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points</td>
			<td>Janome</td>
			<td></td>
			<td>Comes with purchase of Janome Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder</td>
			<td>RatioServ</td>
			<td></td>
			<td>Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer 3 cc Syringes:&#160;</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>122051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Dispenser Tips</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>Z520122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Dioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13462-67-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Mallinckrodt Baker, Inc</td>
			<td>9300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7790-28-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hADSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td>Store in vials in liquid nitrogen until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769&#160;</td>
			<td>10 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptides</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R37606</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability of bioprinted cellular constructs using a three dispenser cartesian printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

結果はbioprinterを正確かつ一貫してコンピュータ支援ソフトウェアを使用して、特定の3次元の位置でセルを含んだヒドロゲルを堆積させることが可能であることを示しています。これらのソフトウェアは、各液滴の配置を決定した （図3,4）を分配するためのパラメータの多くを制御します。適切に生体材料を堆積させるbioprinterの再現は、組織工学アプリケーション?...

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Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

viability-bioprinted-cellular-constructs-using-three-dispenser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K ビュー.  Medical University of South Carolina. A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

生物工学

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

階層化アルギン酸構築：異種細胞集団の共培養のためのプラットフォーム

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &amp;#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

非透明の足場上のイメージング細胞の生存率 - 小説ニットチタンインプラントの使用例

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: 細胞のエネルギー代謝を調査する強力な非侵襲的アプローチ

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

オープンソース、低コストのバイオインク、食品溶融物押出3Dプリンタの設計

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...