この仕事のための資金は、パリベッテンコートIGEMチームのサポートに財団ベッテンコートシュエーラーによって提供されました。我々は、技術支援やアドバイスをINSERM U1001研究ユニットとシャンタルLottonに感謝します。ファージミドLitmus28i_J23115-B0032-GFPは、モニカ・オルティスとスタンフォード大学のドリューENDYによって提供されました。

1.ミドベクターの設計と建設のsRNAサイレンシングカセットベアリング<ol><li> sRNAサイレンシングカセット8のデノボ設計<ol><li> mRNAの完全な配列は、DNA配列データベースを使用してサイレンシングされるように特定します。標的配列を生成するには、開始コドン（ 例えば、ATG）で始まる位置1から24に、コード配列の最初の24塩基対の点に注意してください。 注：他のサイトまたはmRNAのセグメントが8をターゲットとしているときにサイレンシングはあまり効率的です。 </li><li> sRNAカセットのためのガイド配列を生成するために、標的配列の逆相補してください。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のためのTARGETとGUIDEシーケンスの例については、 表1を参照してください。 </li><li> 292 bpの完全なのsRNA発現カセットを設計するには、シリーズのPRプロモーター、ガイド配列、HFQタンパク質結合ドメインおよびT1 / TE転写ターミネーター配列（ 表2）を配置します。 </li><li>ターゲットベクターへのsRNAカセットのクローニングを容易にするための選択肢の追加のクローニングサイトを追加します。 </li><li>商業遺伝子合成を介して、完全なのsRNAカセットまたは類似の方法を取得し、機能f1の複製起点11を有する任意のファージミドベクターにそれをクローン。最終的なファージミドベク​​ターの完全な配列のための情報のサポートを参照してください。 </li></ol></li><li> PCRベースの部位特異的突然変異誘発12を使用して、既存のsRNA発現カセットによって標的とされる配列を変更します<ol><li>既存のsRNA発現カセットに24 bpのガイド配列を特定します。注：この作業で使用される注釈付きpAB.001プラスミドは、補足的なシーケンスファイルとして提供されています。 </li><li>前方デザインと新しい24 bpのガイド配列に隣接する既存のsRNAカセットとの相同性の短い領域とリバースプライマー。商業オリゴヌクレオチド合成によりプライマーを取得します。 注：部位特異的突然変異誘発のためのプライマー設計はdepicですテッドは、 図2の正確なプライマーの鋳型配列を表3に提供されます。 </li><li> Eの5ミリリットルの文化を準備テンプレートのsRNA発現ファージミドを保有する大腸菌 。適切な抗生物質を含むLB培地中で、振盪しながら37℃で一晩細胞を増殖させます。 </li><li> DNAミニプレップキットまたは類似の方法12を用いて、5ミリリットル細菌培養からテンプレートのsRNA発現ファージミドを抽出し、精製します。 </li><li>テンプレートのsRNA発現ファージミドと高忠実度のポリメラーゼ、前方と1とリバースプライマー（ 表4）を持つものを使用して、2つのPCR反応を準備します。ポリメラーゼサプライヤー（ 表5）によって推奨されるようにPCR条件を使用してください。単一プライマー反応が指数関数的増幅が生じないという事実を考慮するために、標準的な反応よりも高い10-50xするテンプレートの濃度を高めます。 </li><li>マイクロチューブに2以上のPCR反応を兼ね備えています。 Annea沸騰水浴中で98°Cに加熱し、L製品。すぐに水浴中でマイクロチューブを配置した後、熱源を除去し、浴をゆっくりと1〜2時間かけて室温に戻すことができます。 </li><li>突然変異していないテンプレートのsRNA発現ファージミドを除去するために、1μlを添加します。混合物にDpnIの制限酵素と1時間、または完全な消化のためにメーカーが推奨する時間、37℃でインキュベートします。 DpnIのは、唯一のメチル化標的部位を消化する、ホストに複製ファージミドではなく、PCR産物上に存在する：注意してください。 </li><li>トランスフォーム13化学的コンピテントE.を購入または準備アニールPCR産物の1-5μlを持つ大腸菌 。適切な抗生物質を含むLB寒天プレート上で選択メッキにより形質転換株の単一コロニーを分離します。 </li><li>正しいガイド配列の組込みを確認するために、コロニーPCRによって得られたコロニーをスクリーニングします。 200μlのピペットチップを用いて、CO単一の形質転換コロニーからの細胞の少量をllect。マークとは、確認後、下流の使用のためにオリジナルのコロニーを維持します。 </li><li>マイクロチューブにヌクレアーゼフリー水50μlに採取した細胞を追加します。ピペッティングにより混和します。 </li><li>ベンチトップの熱サイクラーまたは沸騰水浴を用いて、2分間95℃に加熱することによって細胞を溶解。 </li><li> DNAテンプレートとして熱溶解した細胞の1μLを使用してファージミド地域をPCR増幅します。 PCR条件およびサーモプロトコルは、 表6および7に設けられています。検証プライマー配列の補助pAB.001シーケンスファイルを参照してください。 </li><li>正しいガイド配列の組込みを確認するために、PCR産物を配列決定。 </li><li> Eの5ミリリットルの培養物に接種配列検証のsRNA発現ファージミドを保有する大腸菌クローン。選択LB培地中、振盪しながら37℃で一晩細胞を増殖させます。 </li><li>グリセロールストックを準備します配列検証したクローンの。スクリューキャップクライオチューブに60％グリセロールの250μlに一晩培養物750μlのを追加します。 </li><li>無期限に-80℃でグリセロールストックを保管してください。一晩培養物の残りの部分は、手順2でのsRNA発現ファージミドのソースとして使用することができます。 </li></ol></li></ol> M13パッケージ化ファージミド株式の2生産と収穫<ol><li> Eの5ミリリットルの文化を準備sRNA発現ファージミドを保有する大腸菌 。適切な抗生物質を含むLB培地中で、振盪しながら37℃で一晩細胞を増殖させます。注：のsRNA発現ファージミドは、ステップ1.1.5で説明したようにデノボクローニングして得られた、または変更された既存のファージミドから、ステップ1.2.16で収穫することができます。 </li><li>同様に、Eの5ミリリットルの文化を準備M13KO7ヘルパープラスミドを有する大腸菌 。選択LB培地中、振盪しながら37℃で一晩細胞を増殖させます。 </li><li> sRNA expressioを抽出し、精製DNA抽出キット又は類似の方法12を用いて、nは、ファージミドとヘルパープラスミド。 </li><li> Cotransformは、購入または1μlののsRNA発現ファージミドとヘルパープラスミドのそれぞれと13の化学的にコンピテント大腸菌を用意しました。両方の構築のための選択的抗生物質を含むLB寒天上にプレーティングすることにより共形質転換体のために選択します。 </li><li>選択的抗生物質を含むLB中で同時形質転換株の単一コロニーから10ミリリットル文化を準備します。 8-12時間または一晩振とうしながら37℃でインキュベートします。 </li><li> 10分間、3300×gで文化を遠心。 0.2μmのフィルターを通して上清およびフィルタを収集します。注意：メディア流出の場合には、感染性ファージ粒子を破壊するために希薄漂白剤（0.5％）でエリアを清掃してください。 </li><li> 4℃でパッケージ化されたファージミドろ液を保管してください。注：サンプルは、活性の損失なしに数日から数週間維持することができます。 </li></ol>サイレンシングのためのF +標的細胞の調製<ol><li>サイレンシングの標的とされる細胞はF線毛14を表現するかどうかを確認します。 F線毛がすでに存在する場合は、手順4に進みます。 注：Eの一般的な実験室株を大腸菌は、それらのゲノムまたはプラスミド上のF線毛の存在を示すために、F +またはF &#39;と注釈されています。 </li><li> EのF +株を取得大腸菌などTOP10F &#39;として。 注：ターゲット株は共役後のF-プラスミドドナーから分離するために、ユニークな耐性マーカーを保有することを確認してください。 </li><li> F +株との結合により、F線毛を導入するために、標的株とF-プラスミドドナー14の両方の5ミリリットルの文化を準備します。適切な抗生物質を含むLB培地中で、振盪しながら37℃で一晩細胞を増殖させます。 </li><li>次の日、両株1希釈する：選択LBの5ミリリットルで100を振とうしながら37℃で培養を継続します。 </li><li> OPTを測定することにより、細胞の増殖期を決定しますベンチトップ型分光光度計を用いて600 nmの（OD 600）での文化のiCalの密度。培養物を0.3のOD 600まで、約2時間、細胞を対数増殖期15を示し、達成されます。 </li><li>マイクロ遠心チューブに3結合反応を準備：0.5ミリリットルF-プラスミドドナー+ 0.5ミリリットル標的株、0.5ミリリットルF-プラスミドドナー+ 0.5ミリリットルのLB培地（陰性対照）および0.5ミリリットル標的株+ 0.5ミリリットルのLB培地（ネガティブコントロール）。結合は振盪しながら37℃で2時間進行させます。 </li><li>プレートF-プラスミド（典型的には、テトラサイクリン）と標的株に特異的な抗生物質を選択的LB寒天上の各結合反応を100μl。どちらのドナーまたはレシピエント株は、両方の抗生物質耐性を発現することを確認するために、ネガティブコントロール反応をプレート。 </li></ol>サイレンシングのためにパッケージ化されたファージミド4.感染<ol><li> LBのメディ5mlの培養液中にF +標的細胞の単一コロニーを接種適切な抗生物質を含みます。振盪しながら37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、1 F +標的細胞を希釈：選択LB培地の5ミリリットルで100、振とうしながら37℃で培養を続けます。 </li><li>ベンチトップ型分光光度計を用いて600 nmの（OD 600）での培養物の光学密度を測定することによって、細胞の増殖期を決定します。培養物を0.3のOD 600まで、約2時間、細胞を対数増殖期15を示し、達成されます。注：F線毛の発現と感染効率は、対数期で最も高いです。 </li><li>標的集団の約99％の感染を達成するために、100：1の体積比で標的細胞に（ステップ2.6）からM13パッケージファージミドを加えます。感染は30〜60分間振盪しながら37℃で進行させます。 </li><li>選択の方法に応じたsRNAサイレンシング表現型をアッセイ。 注：蛍光タンパク質標的の場合、消音効果を定量化することができます直接蛍光法10による。あるいは、表現型のアッセイは、遺伝子ノックダウン8の表現型の影響を観察するために使用することができます。 </li><li>手順1.2.14-1.2.16次のsRNAを発現するファージミドホストのグリセロールストックを準備します。注：ファージミドは、無期限に宿主株に伝播すると、従来のプラスミドに抗生物質類似して維持することができます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

本発明の方法は、非標的対照と比較してmKateの蛍光レベルで80％の削減を達成しました。これは完全なサイレンシングが観察され、百分の50から90の効率が16,17典型的であるされていない他のRNAノックダウンの方法、に沿ったものです。表現型レベルでは、CAT-標的ノックダウンは著しくクロラムフェニコール耐性を減衰し、いくつかの条件の下でそれを除去することができました。 ノックダウン表現型はわずか数時間後に感染（ 図3B）の後に集団レベルで検出可能でした。これは、ファージに基づく配信の重要な特徴を示しています。高いノックダウン周波数は、従来、遺伝子改変することなく、バッチ培養で直接得ることができます。プラスミド形質転換またはゲノム統合を用いた従来の遺伝的修飾とは異なり、ファージ感染は、人口が単一の孤立コロニーから再成長されることを必要としません。これは、ファージ感染の影響がEXPLORにすることができます18、または遺伝的に混合自然集団19におけるバイオフィルムのような既存の空間構造を持つ複雑な空間ダイナミクス11、と集団で編。 この方法における重要なステップは、高力価でパッケージ化されたファージミドの製造です。ファージ粒子の生産に関連する代謝負担がファージミド生産菌株における突然変異またはプラスミドの損失率の高さにつながる可能性があります。ファージミド生産菌株は、単一の同時形質転換コロニーから直接培養し、冷蔵ではない、凍結またはファージ収穫前に継代培養することをお勧めします。 E.にファージミドおよびヘルパープラスミドを導入する際に同時形質転換の効率が低いことも観察することができます同時に大腸菌 。この場合には、より高い効率が次にファージミドを用いたその後の形質転換のためのヘルパープラスミドを有するコンピテント細胞を調製し、第1のヘルパープラスミドを形質転換することにより得ることができます。 PHAgemid感染またはのsRNA発現はまた、標的細胞上の検出可能な代謝負担を課し、そしていくつかの表現型の摂動をもたらすことができます。例えば、mKate2蛍光の減少は、細胞はCAT（ 図3）を標的とファージミドを感染させた場合にも観察されました。 M13での感染は、Eにおける全身ストレス反応を誘発すると考えられていません20 コリが、間接的に転写パターンを変更することができます。代わりに、ファージミドに含まれるGFPまたはアンピシリン耐性マーカーはmKate2発現と成長9を軽減、携帯リソースの競合があります。最後に、のsRNAカセット自体がグローバルHFQタンパク質を滴定することによって遺伝子発現プロファイルを変更、またはオフ標的mRNAサイレンシングを介してあります。オフターゲット効果は、in vivoでのRNAi 21-23を標的化するのに共通しているが、彼 ​​らは体系的に、このシステムのために調査するには至っていません。 この方法の1つの制限は、感染EFFIということですciencyは、いくつかの非感染細菌の集団に固執することができ、100％未満です。この作業の結果とそれ以前の作品10は、非感染細胞は、最終的な人口の1から10パーセントを表していることを示唆し、観察nonsilenced表現型のほとんどを担っています。 M13-抵抗への経路の様々な線毛式24の最も一般的な突然変異の損失で、知られています。これらの制限を考慮して、コントロールが高い感染率とノックダウン効率を確認するために使用されるべきです。 いくつかのアプリケーションのための別の潜在的な制限は、ヘルパーファージを汚染時折転送です。 M13K07は、突然変異したパッケージングシグナルを含んでいますが、それは、ファージ生産と最初の感染イベント25を超えたファージの継続的な普及のためのコンピテントセルで、その結果、低周波数でのファージキャプシド中にパッケージングし、感染した集団に転送することができます。ヘルパーファージへの変更が有効であることが判明しました減少したファージ生産26の費用であるが、時には、非特異的なパッケージングを減らすことで。 操作されたバクテリオファージは、Eのための必要不可欠なツールとなっています人口増加への新しい遺伝子の迅速な配信を可能にする大腸菌合成生物学、。最近の研究では、27を経路抗生物質耐性を抑制するために細胞間通信回路11または発現された転写因子を生産しています。ここで紹介するプロトコルは、プログラムされたRNAを介して細菌生理学の制御を可能にするツールの成長のコレクションに追加されます。ヌクレアーゼ活性を排除するために変異したときCRISPR-CASヌクレアーゼは、RNA誘導型遺伝子標的17,28で転写を抑制することが示されています。これとは対照的に、のsRNAサイレンシングは、翻訳レベルで動作し、外因性タンパク質の発現を必要としません。次世代バイオテクノロジーは、複雑なフェノをプログラムするために、ファージ媒介送達での転写および翻訳制御を団結させることができますリアルタイムでタイプ。

RNA媒介遺伝子ノックダウンは、2段階で進行します。まず、RNA分子は、研究の細胞株または生物体に導入されます。第二に、内因性RNA結合タンパク質は、RNA標的の認識を容易にし、消音効果をもたらします。すべてのRNAノックダウン技術は簡単に関心のある特定のターゲットに適合するように製造することができる合成sRNAsのカスタマイズ可能な性質、恩恵を受ける。しかし、RNAの取り込みおよびサイレンシングの分子の詳細は、どこで、どのようにRNAのノックダウンを適用することができる拘束、モデル系全体に広く変化します。 線虫では、二本鎖RNA（dsRNA）分子は、培地中またはdsRNAを発現する大腸菌の集団とワームを供給することによって直接導入することができます大腸菌細胞を1,2。 ショウジョウバエにおいて、RNAiは、dsRNA 3で胚をマイクロインジェクションすることによって達成することができる、または単に培地4へのdsRNAを添加することにより細胞株で実施しました。哺乳動物細胞株において、合成低分子干渉RNA（siRNA）は、エレクトロポレーション1,2,5により生細胞に送達するリポソーム3,6にパッケージ化、又はDNAプラスミドベクター4,7から発現され得ます。 RNA種が細胞質ゾルに到達すると、RNAi経路は、該dsRNAを処理対象のアンチセンス認識を容易にし、ホストに依存して、翻訳抑制、mRNA分解、またはヘテロクロマチンの形成を触媒するためにRISC複合体に依存しています。 そのため、これらの要件のため、古典的なRNAiは、唯一の効率的外因性RNAを取り上げ、RISCまたはRISCライクな活性を発現する生物で行うことができます。注目すべきことに、このモデル細菌E.を除外しますRNAi経路を欠いている大腸菌 、。しかし、合成生物学の最近の進歩は、配信の問題とサイレンシングの問題の両方を解決するためのツールを提供しています。 このプロトコルでは、のsRNA構築物を大腸菌で発現されますリーに送達DNAベクターから大腸菌M13ファージミド/ヘルパーシステムを用いて細胞をレイムス。ファージミドは、複製のファージ由来のf1を原点とする任意のプラスミドです。ヘルパープラスミドは、この場合M13KOに、ウイルス粒子を生成するのに必要なすべての機械を運び、それ自体は複製およびパッケージングのために有能ではありません。ファージミドおよびヘルパープラスミドを同時形質転換された場合、単独のファージミドは、パッケージ化され、分泌され、f1の原点に複製されます。ベクトル化ファージミドは、ライブE.に感染する能力がありますF線毛を介した大腸菌 。 このシステムでは、サイレンシング効果は、標的結合配列を有する骨格配列を組み合わせたカスタムのsRNAカセットによって産生されます。標的結合配列は、典型的には、リボソーム結合部位（RBS）で、mRNA標的に対するアンチセンス24塩基対です。 Naおよび同僚8によって開発された足場のシーケンスは、MICC、Eに内因性の小さな調節RNAから抽出HFQ結合モチーフが含まれています大腸菌 。 HFQタンパク質は、RNA-RNAバインディンを刺激しますgであり、mRNA分解、RNAiの中でRISCに似たこのシステムの役割を提供する。 図1のsRNAカセット構造、ファージミドベクトル化、およびサイレンシング機構を備えたファージ媒介のsRNAノックダウンのための完全なスキームを、示しています。 大腸菌における遺伝子発現を調節する方法として大腸菌 、のsRNAサイレンシングは、簡単、迅速かつ汎用性があります。対象とE.大腸菌は、ファージミドを伝播するとのsRNAを表現超えて負荷がかかりません。これは、より大きな異種構築物の発現は、細胞資源9に負担することができます合成生物学や基礎研究の文脈で関連している可能性があります。新しいターゲットとのファージミドは、単一のPCRにより生産され、ファージミド転換の1日後に収穫することができます。最後に、ほぼすべてのmRNAを標的とすることができます。 （標準プラスミド上）のsRNA規制カセットは&gt; 90％8典型的な抑制レベルと代謝に種々の標的に作用することが示されています。 10をカセットを使用して、以前の作業を拡張したものです。まず、パッケージ化されたファージミドは、Eのバッチ培養に導入され、 coli細胞と蛍光タンパク質mKate2の発現を抑制するために使用されます。その後の蛍光の変化をリアルタイムでモニターされます。第二に、CAT遺伝子をノックダウンする寒天プレート上での表現型クロラムフェニコール耐性を減少させることが示されています。両方の場合において、ファージミド自体は感染率は、独立して、ノックダウン効率を測定することができるように、GFPマーカーを運びます。

<table><tbody><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzyme</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 Helper Phage</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F&#039; Cells</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

RNA媒介性ノックダウンは広く、遺伝子発現を制御するために使用されます。技術のこの多目的ファミリーは、任意の順序で合成し、サイレンシングを対象とした遺伝子を補完するように設計することができ、短いRNA（のsRNA）を利用します。 sRNA直接多くの細胞型に導入されるか、または種々のベクターを使用することができる構築ので、遺伝子発現は、面倒な遺伝子改変することなく、生細胞内で抑制することができます。最も一般的なRNAノックダウン技術、RNA干渉（RNAi）は、標的mRNAの内因性RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）媒介する配列認識および切断を利用します。この技術の応用は、したがって、RISC発現生物、主に真核生物に限定されています。最近では、RNAの生物工学の新世代は、RNAを介して遺伝子発現を制御するための代替メカニズムを開発している、などの細菌で可能RNA媒介遺伝子ノックダウンを行いました。ここでは、遺伝子EXPRESをサイレンシングするための方法を説明しますE.でシオン機能的にRNAiを似ている大腸菌 。このシステムでは、合成ファージミドは、任意の配列を標的とするように設計することができるのsRNAを発現するように設計されています。発現構築物は、 大腸菌の集団に送達されます安定してプラスミドとして複製することができ、その後、非溶解性M13ファージによる大腸菌細胞、。アンチセンス認識及び標的mRNAのサイレンシングはE.に対して内因性HFQタンパク質によって媒介されます大腸菌 。このプロトコルは、アンチセンスのsRNAを設計するファージミドベク​​ターを構築し、M13バクテリオファージにファージミドのパッケージング、感染のために生きた細胞集団を調製し、感染そのものを実行するためのメソッドを含んでいます。蛍光タンパク質mKate2及び抗生物質耐性遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）は、代表的なデータを生成し、ノックダウン効果を定量化するために標的化されます。

液体媒体中mKate2蛍光のサイレンシング 図1は、のsRNAカセットの設計、ファージミドベクトル化、およびサイレンシング機構を備えたこの研究に記載のsRNA媒介ノックダウンのためのスキームを示します。プロトコル1.2に続いて、プラスミドpAB.001ののsRNAサイレンシングカセットはmKateを標的とするように変更されました。 sRNAカセットは、合成さやファージミドLitmus28i_J23115-B0032-GFP、モニカ・オルティスとドリューENDY 11からの贈り物にクローニングしました。このファージミドは、成功した感染を追跡できるように、GFP発現およびカナマイシン耐性のマーカーを運びます。パッケージ化されたファージミドの株式は、プロトコル2に従って調製しました。 Eの微分恒常的に発現、染色体に組み込まれmKate2マーカーを保有する大腸菌 K12 MG1655は、コンジュゲーションによってファージ感染のために準備されました<html>対数期中期およびファージミド感染後のプロトコル4.次の導入ファージミドに成長させたプロトコル3.細胞を、以下のFプラスミドドナー株と、200μlの培養物を、蛍光プレートリーダーに移し、蛍光を24時間継続的に監視しました。 図3は mKate2発現に対するのsRNA媒介サイレンシングの効果を示しています。抗mKate2ファージミドを感染させた株は、バックグラウンドを超える検出可能mKate2蛍光を示しませんでした。対照的に、この株は、ファージミドの成功した取り込みを示す、GFPマーカーを発現しました。非感染対照細胞はmKate2蛍光なくGFPを生成しました。抗mKate2ターゲティングドメインは、CATを標的配列と置換した付加的な制御は、mKate2蛍光に影響を及ぼしませんでした。 寒天プレート上のクロラムフェニコール抵抗性のサイレンシングsRNAサイレンシングカセットはCATを標的とするように製造されたプロトコル1.1、続いて1 &quot;&gt;恒常的に発現し、染色体に組み込まれたCATのマーカーを保有する大腸菌 K12 MG1655の誘導体をのために調製した：「キープtogether.within-ページ= foの「コンテンツ。プロトコル3.細胞以下のF-プラスミドドナー株との結合によってファージ感染は、対数期中期まで増殖させ、ファージミドは、37℃でのインキュベーションの1時間後にプロトコル4.以下の導入、感染した細胞を連続希釈しでプレートしましたクロラムフェニコール濃度。プレート範囲を一晩インキュベートし、そしてそれぞれのクロラムフェニコール濃度で耐性細胞の割合は、コロニー形成単位（CFUの）次の日をカウントすることによって決定しました。 図4は、クロラムフェニコール耐性表現型上のsRNA媒介サイレンシングの効果を示しています。 mKate2をターゲットファージミドを感染させた非感染細胞、または細胞は、に耐性でした試験した全ての濃度で、クロラムフェニコール。対照的に、CATを標的とファージミドに感染した細胞は、低クロラムフェニコール濃度で減少生存率を示し、ほぼ99％が高濃度で殺します。アンピシリンを加え、ファージミドを運ぶ細菌のみを選択するためには、検出不可能なレベルにクロラムフェニコールの生存率を減少させました。これは、ファージ感染からの脱出が10をサイレンシング脱出する一般的な経路であることを示す以前の研究と一致しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> 図1： 大腸菌 における遺伝子サイレンシング sRNA発現カセットを持つ 大腸菌は、M13 ファージで配信のsRNAカセットは、4つのモジュールから構成されています。PRプロモーター（バクテリオファージラムダ由来構成的プロモーター）、24 bpの標的ドメイン、HFQ結合ドメインは、MICCから抽出および転写ターミネーター8 </SUP&gt;。カセットは、M13のF1複製起点を担持するファージミドに組み込まれ、ヘルパーファージM13KO7を使用して、M13キャプシドにパッケージ化されています。パッケージ化されたファージミドは、Eに感染することができますsRNA式が始まるF線毛を発現する大腸菌 。 sRNAは、その後、（赤で示されている）HFQタンパク質を動員し、翻訳抑制とmRNA分解の結果、リボソーム結合部位の近くにアンチセンスmRNA標的に特異的に結合する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> 図2：プライマー設計とのsRNAターゲットサイトの部位特異的突然変異誘発は、2つのプライマーを、既存のsRNAカセットへの部分的な相同性を有するように設計されています。フォワードプライマーは、続いて、5 &#39;末端にPRプロモーターに20 bpの相同性を含有します新しいガイド配列を表す24塩基対、3 &#39;末端にHFQ結合ドメインへ、次いで18 bpの相同。逆方向プライマーは、新しいガイド配列の逆相補体に隣接する既存のsRNAカセットと相同性の領域を有するフォワードプライマーの正確な逆相補体、です。正確なプライマー配列を表3に示す。フォワードおよびリバースプライマーを用いた個別の単一プライマーPCR反応は、所望の改変配列を有する直鎖、一本鎖DNAを生成します。前方と希望の修正のsRNAカセットを担持する二本鎖プラスミドDNAでクリーンアッププロトコールに記載されているように、結果に続いて、反応生成物を逆にアニールする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> 図3：K染色体に組み込まれmKate2蛍光レポーターのnockdown。E. mKate2を発現している大腸菌 MG1655 K12は、未処理（赤色の線やバー）左抗mKate2ファージミド（緑色の線やバー）に感染し、またはCAT（青い線やバー）を標的と対照ファージミドを感染させたいずれかでした。 （A）未処理E.大腸菌は、ファージ感染への代謝コストを示す、より高い飽和密度まで成長しました。点線は3反復の標準偏差を示します。 （B）mKate2信号抗mKate2近バックグラウンドレベルに低下したのではなく、コントロール株で、歪みを処理しました。また、ファージミドによって運ば（C）GFP蛍光は、わずかファージミド処置コントロールで検出可能でした。 （D、E）の最終蛍光読み取り成長の24時間は、ODに標準化した後。 GFPシグナルは、ファージミドの感染を示す、未処理の対照には存在しなかったが、また、実質的に抗CAT pを以下に低減しますhagemid治療。これは、ファージミドのオフターゲット効果を示すことができます。 mKate2信号は、未処理対照と比較して、抗mKate2ファージミド処理により減少しました。 CAT-制御目標ファージミドはmKate2の蛍光に対する効果を示しませんでした。エラーバーは3反復の標準偏差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> 図4：CATのノックダウンは、遺伝的に耐性人口にクロラムフェニコール感受性を復元E.。染色体に統合されたCAT遺伝子を発現する大腸菌 MG1655 K12はmKate2（緑のバー）を標的とする対照ファージミドで処理した未処理（赤色バー）、左、または抗CATのsRNA（青いバー）を発現するファージミドを用いて処理しました。感染の1時間後、指示されたアリ上の生存率ibioticsは段階希釈およびプレーティングすることによって評価しました。対照処理は影響を受けなかった一方で抗CATミドで処理された株が大幅に、より高い濃度でクロラムフェニコールにより（&gt; 90％）を殺害しました。培養プレートにアンピシリンを追加すると、積極ファージミド感染のために選択し、非感染細胞を排除します。これらの条件下では、何のクロラムフェニコール耐性コロニーを、抗CAT処置後に観察されませんでした。これは、ほとんどの生存者が感染の故障ではなく、サイレンシングの失敗を表していることを示しています。エラーバーは3反復の標準偏差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> CAT標的配列</td><td> 5 &#39; - ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> CATのガイド配列</td><td> 5 &#39; - ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> 表1：CAT遺伝子のための例示TARGETとガイド配列は、逆相補関係に注意してください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PRプロモーター</td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td>ガイド配列</td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> HFQ結合ドメイン</td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / TEターミネーター</td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>表2：のsRNAカセットのシーケンス成分それぞれの配列は、5&#39;-3 &#39;に書き込まれます。完全なカセットがために、これらの4つの要素を連結したものですと292塩基対を含みます。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 5 &#39; - CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td> 5 &#39; - GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> 表3：プライマーの設計既存のガイド要素を変更するためのフォワードプライマーは、PRプロモーターの最後の20bp、新しいガイド配列、およびHFQ結合ドメインの最初の18塩基対を含んでいます。標的配列は、ガイド配列の正確な逆相補体です。逆方向プライマーは、フォワードプライマーの正確な逆相補体です。 </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>成分</td><td>ボリューム</td></tr><tr><td>テンプレートプラスミド</td><td> 500 ngの</td></tr><tr><td> 10μMプライマー</td><td> 2.5μlの</td></tr><tr><td> 10mMのdNTPを</td><td> 0.4μlの</td></tr><tr><td>高忠実度ポリメラーゼ（2 U /μl）を</td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> 5X PCRバッファー</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>全容積</td><td> 50μlの</td></tr></tbody></table> 表4：シングルプライマー突然変異誘発PCRの推奨条件。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ステップ</td><td>一時</td><td>時間</td></tr><tr><td>最初の変性</td><td> 98°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td rowspan="3"> 30サイクル</td><td> 98°C </td><td> 10秒</td></tr><tr><td> 55°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 72°C </td><td> 120秒</td></tr><tr><td>最終的な拡張</td><td> 72°C </td><td> 300秒</td></tr><tr><td>ストレージ</td><td> 10°C </td><td></td></tr></tbody></table> 表5：シングルプライマー突然変異誘発PCRのためにサーモプロトコル推奨。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>成分</td><td>ボリューム</td></tr><tr><td>テンプレートDNA </td><td> 1μlの</td></tr><tr><td> 10μMのフォワードプライマー</td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> 10μMのリバースプライマー</td><td> 0.5μlの</td></tr><tr><td> Taq 2Xマスターミックス</td><td> 25μlの</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォートR </td><td> 23μlの</td></tr><tr><td>全容積</td><td> 50μlの</td></tr></tbody></table> 表6：シーケンスの検証PCRの推奨条件。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ステップ</td><td>一時</td><td>時間</td></tr><tr><td>最初の変性</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td rowspan="3"> 30サイクル</td><td> 95°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 55°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td> 68°C </td><td> 30秒</td></tr><tr><td>最終的な拡張</td><td> 68°C </td><td> 300秒</td></tr><tr><td>ストレージ</td><td> 10°C </td><td></td></tr></tbody></table> 表7：推奨サーモプロシーケンス検証PCR用トコール。

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

ターゲティングされたのsRNAのファージ媒介送達はにおける遺伝子発現をノックダウンするために構築します<em&gt; E。大腸菌</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.5K ビュー.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

生物工学

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

遺伝学

Application of CRISPR Interference (CRISPRi) for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by pathogenic and virulent bacteria of the genus Leptospira, either by direct contact with the bacteria or indirectly by exposure to contaminated water or soil. Domestic and wild animals act as reservoir hosts of infection, shedding leptospires from colonized renal tubules of the kidney, via urine, into the environment. The generation of mutant strains of Leptospira is critical to evaluate and understand pathogenic mechanisms of infection. CRISPR interference (CRISPRi) has proven to be a straightforward, affordable, and specific tool for gene silencing in pathogenic Leptospira. Therefore, the methodological details of obtaining the plasmid constructs containing both dCas9 and guide RNA, delivery of plasmids to Leptospira by conjugation with the E. coli strain &#946;2163, and transconjugant recovery and evaluation, will be described. In addition, the recently described Hornsby-Alt-Nally (HAN) media allows for the relatively rapid isolation and selection of mutant colonies on agar plates.

Application of CRISPR Interference CRISPRi for Gene Silencing in Pathogenic Species of Leptospira

Here, the application of CRISPR interference (CRISPRi) for specific gene silencing in Leptospira species is described. Leptospira cells are transformed by conjugation with plasmids expressing dCas9 (catalytically "dead" Cas9) and a single-guide RNA (sgRNA), responsible for base pairing to the desired genomic target. Methods to validate gene silencing are presented.

レプトスピラの病原性種におけるCRISPR干渉(CRISPRi)の遺伝子サイレンシングへの応用

Leptospirosis is a global neglected zoonosis, responsible for at least 1 million cases per year and almost 60 thousand deaths. The disease is caused by ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAiのエフェクターの細菌配達：Transkingdom RNAiの

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

生物学

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1 
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA
Transduction is a form of genetic exchange between bacteria that utilizes bacteriophages, or phages, a class of virus that infects exclusively prokaryotic organisms. This form of DNA transfer, from one bacterium to another by way of a phage, was discovered in 1951 by Norton Zinder and Joshua Ledererg, who termed the process &#34;transduction&#34; (1). Bacteriophages were first discovered in 1915 by British bacteriologist Frederick Twort, then independently discovered again in 1917 by French-Canadian microbiologist Felix d&#39;Herelle (2). Since then, the structure and function of these phages have been widely characterized (3), dividing these phages into two classes. The first of these classes are the lytic phages which upon infection multiply within the host bacterium, disrupting the bacterial metabolism, lysing the cell, and releasing progeny phage (4). As a result of this anti-bacterial activity and the increasing prevalence of antibiotic-resistant bacteria, these lytic phages have recently proved useful as a substitute treatment for antibiotics. The second of these classes are the lysogenic phages which can either multiply within the host via the lytic cycle or enter a quiescent state in which their genome is integrated into that of the host (Figure 1), a process known as lysogeny, with the ability for phage production to be induced in multiple later generations (4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig1.jpg" /> 
Figure 1: Infection of host cell by bacteriophage. Adsorption by the phage to the bacterial cell wall via interactions between the tail fibers and receptor (purple). Once on the cell surface, the phage is irreversibly attached to the bacterial cell using the base plate (black) which is moved to the cell wall by the contractile sheath (yellow). Phage genome (red) then enters the cell and integrates into the host cell genome.
While bacterial transduction is a naturally occurring process, using modern technology it has been manipulated for the transfer of genes into bacteria in the laboratory setting. By inserting genes of interest into the genome of a lysogenic phage, such as phage, one is able to transfer these genes into the genomes of bacteria and consequently express them within these cells. While other methods of gene transfer, such as transformation, use a plasmid for gene transfer and expression, the insertion of the phage genome into that of the recipient bacterium not only has the potential to confer new traits to this bacterium, but also allows for naturally occurring mutations and other factors of the cellular environment to alter the function of the transferred gene.
Compared to other methods of horizontal gene transfer, such as conjugation, transduction is fairly flexible in the criteria required for donor and recipient cells. Any genetic element that can fit inside the genome of the phage being used can be transferred from any strain of donor bacteria to any strain of recipient bacteria as long as both are permissive to the phage, requiring the expression of necessary phage receptors on the cell surfaces. Once this gene is moved out of the donor genome and packaged into the phage, it can be transferred to the recipient. Following transduction, it is necessary to select for recipient bacteria that contain the gene of interest have to be selected for. This could be done by use of a genetic marker, such as a FLAG-tag or polyhistidine-tag, to mark the gene of interest, or the intrinsic function of the gene, in the case of genes that encode for antibiotic resistance. Additionally, PCR could be used to further confirm successful transduction. By using primers for a region within the gene of interest and comparing signal to a positive control, bacteria that has the gene of interest, and a negative control, bacteria that underwent the same steps as the transduction reaction with no phage. While bacterial transduction is a useful tool in molecular biology, it has and continues to play an important role in the evolution of bacteria, particularly with regard to the recent rise of antibiotic resistance.
In this experiment, bacterial transduction was used to transfer the gene encoding for resistance to the antibiotic ampicillin from the W3110 strain of E.coli to the J53 strain via the P1 bacteriophage (5). This experiment consisted of two main steps. First, the preparation of P1 phage containing the ampicillin resistance gene from the donor strain. Second, the transfer of this gene to the recipient strain by transduction with the P1 phage (Figure 1). Once carried out, the successful transfer of the ampicillin resistance gene could be determined by qPCR (Figure 2). If transduction was successful, the J53 strain of E. coli would be resistant to ampicillin, and the gene conferring this resistance detectable by qPCR. If unsuccessful, there would be no detection of the ampicillin resistance gene and ampicillin would still function as an effective antibiotic against the J53 strain.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10517/10517fig2.jpg" /> 
Figure 2: The confirmation of successful transduction by qPCR. By comparing the Cq values detected for the gene of interest from the transduction reaction and the negative control reaction, and normalizing these values against a housekeeping gene, one was able to confirm that bacterial transduction was successful.

Phage Transduction: Transferring Ampicillin Resistance in E. coli

ファージトランスダクション:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に伝達する方法

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

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高等生物学

微生物学

RNAi Plating for C. elegans Feeding: A Technique to Induce Target dsRNA Expression in E. coli

Source: Kolundzic, E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56889/application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression">Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the principles behind RNAi treatment in C. elegans and demonstrates a protocol to knockdown lin-35 in a transgenic worm strain.

C. elegans摂食のためのRNAiプレーティング:大腸菌における標的dsRNA発現を誘導する技術

Source: Kolundzic, E., et al. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in&#160;C. ...

ターゲティングされたのsRNAのファージ媒介送達はにおける遺伝子発現をノックダウンするために構築します

要約

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