MG, MO'C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Herv&#233; Cottet (Montpellier) for discussions.

キトサンフィルムの調製<ol><li>超純水で100mlに完全に氷酢酸の2グラムを、計り分けます。 </li><li> 2％メートル/ mの酢酸水溶液100mlを追加し、キトサン粉末のうち1.7グラムの重量を量ります。どちらかアルミホイルで、または暗闇の中で覆われて、室温で攪拌棒および磁気撹拌プレートで5日間撹拌します。 </li><li> 1時間、23℃で1076×gでキトサン分散液を遠心分離します。シリンジを用いて上清を回収し、沈殿物を捨てます。 </li><li>室温の9センチのプラスチックシャーレに各フィルム、アリコートキトサン懸濁液を10ミリリットルのため。少なくとも7日間乾燥さ覆われたフィルムを残します。 </li><li>はさみを使用すると、1×1cmの正方形にドライフィルムをカット。注意：実験は、この段階で一時停止することができます。 </li></ol>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の調製<ol><li> 8グラムの塩化ナトリウムを秤量0.2グラムの塩化カリウム1.44グラムのナトリウム水素PHOS酸塩0.24グラムのリン酸二水素カリウム。 </li><li>超純水800mlにこの秤量化学物質を溶解し、pH7.4に濃塩酸で溶液を滴定します。 注意：実験は、この段階で一時停止することができます。 </li></ol> pHは9.2で、75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液の調製<ol><li>ホウ酸の3.0915グラムを量り分けます。超純水75 ml中に溶解します。 </li><li> 10 M以上の濃度の水酸化ナトリウム溶液で9.2のpHをホウ酸溶液を滴定します。 注意：濃水酸化ナトリウム溶液は腐食性であり、手袋をして取り扱ってください。 </li><li>溶液100mlを得るために、超純水で完了する。これは、pH 9.2での500mMホウ酸ナトリウム緩衝液をもたらします。 </li><li> 75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液に超純水で500 mMのホウ酸ナトリウム緩衝液を希釈します。注意：実験は、この段階で一時停止することができます。 </li></ol>キトサンFiは4準備グラフト反応のためのLMS <ol><li>室温でのペトリ皿に2時間5mlのPBSで10平方キトサンフィルム（1×1センチ）すすぎます。 </li><li>この間、キャピラリー電気泳動装置（ステップ5）を調製し、検証します。 </li></ol> 5.キャピラリー電気泳動機器の準備と検証<ol><li> 50μmの内径43.5センチメートル裸の溶融シリカキャピラリーを準備すると設定された長さで、キャピラリーのポリマー外側コーティングを弱めることによって（全長、検出ウィンドウへの効果的な長さは43.5センチメートル通常、35センチメートルです）鈍い器具は、次にキャピラリをスナップ。 <ol><li>入口から8.5センチメートルでのポリマーコーティングを燃やすためにライターを使用することにより、キャピラリーのためのウィンドウを作成し、それを冷却した後、エタノールでそれを拭いてください。軽量化と数ミリメートルのための各端部でキャピラリーのコーティングを燃やす、そしてそれが冷却した後、エタノールでそれを拭いてください。 </li><li>キャピラリーINSIを配置検出ウィンドウドと入口と出口に同じ長さでそれを配置し、カセットのスピンドルの周りに巻き付けることによりキャピラリーカセットに取り付けます。そして、キャピラリー電気泳動装置にカセットを取り付けます。 </li></ol></li><li>各分離するための方法のパラメータを設定します。ソフトウェアのメニューで、「方法」、次に「メソッド全体の編集」を選択します。 （例えば、25℃、10分、30キロボルト）分離のために用いられる温度、時間、電圧、およびバイアルを設定します。 <ol><li>プレコンディショニングセクションにおいて、連続フラッシングセット（水中）、1M水酸化ナトリウムで10分、（水に）0.1 M水酸化ナトリウムで5分間、超純水及び75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液で5分で5分間一連の分析の第一の方法のためのpH 9.2で。 </li><li> （水中）1 M水酸化ナトリウム、pHが9時75 mMのホウ酸ナトリウム緩衝液で5分間で1分：後続のメソッドの場合、セットにプレコンディショニングセクション内の連続フラッシュを設定します。2。 </li><li>注入部では、すべてのメソッドのために10秒間30ミリバールの圧力で流体力学的注射のためのパラメータを設定します。分離部では、すべてのメソッドのための9分間、25℃で30 kVのに分離条件を設定します。 注：メーカーの間で変化してもよいCE機器を操作するための手順として、特定のCE機器のマニュアルを参照してください。日に1 M水酸化ナトリウム溶液を調製します。 </li></ol></li><li>注入し、（75mMのホウ酸ナトリウム緩衝液450μlの中に希釈した水に、10％v / vのジメチルスルホキシド10μlの（DMSO））ニュートラル内部標準を分離します。キャピラリーの有効性を確認するために、そして（材料のリストを参照してください10グラム∙L -1で超純水に溶解した）オリゴアクリレートの標準と同じように注入し、独立しました。グラフト反応を開始する準備ができるまで、ここでシーケンスを一時停止します。 </li></ol>キトサンフィルム上にRGDSの6グラフト<ol><li>ペプチドを秤量（1mgのRGDS）そしてカップリング剤（3 mgのEDC-HClおよび2mgのNHS）。 </li><li> 2時間PBS中キトサンフィルム浸漬開始後、ペプチド及びPBS 5ml中のカップリング剤を溶解します。 <ol><li>この溶液の50μlのアリコートを取ります。アリコートに内部ニュートラル標準としての水中で10％（v / v）のDMSOの2μLを加えます。 CEとのアリコートを分析する（ステップ7を参照）。 </li></ol></li><li> 5mlのPBSを削除するペトリ皿からキトサンフィルムをリンスするために使用。キトサンフィルムを含むペトリ皿にペプチドとカップリング剤5mlの溶液を加えます。 </li><li>パラフィンフィルムでペトリ皿を覆い、室温でオービタルシェーカー上に置きます。設定した時刻に反応媒体の50μlのアリコートを取ります。 注：CEとの合計分析時間は、15分では、このように一定分量を15分毎（または2つの反応が並行して監視される場合、30分毎など ）をとることができます。 <ol><li>各アルの内部ニュートラル標準としての水中で10％（v / v）のDMSOの2μLを加えますiquot。 注：一定分量は、すぐに彼らが取られるようにCEを用いて分析する必要があります（ステップ7を参照）。 </li></ol></li><li>揺れやアリコート除去の4時間後、シェーカーからペトリ皿を削除します。ペトリ皿からの反応媒体を削除します。キトサンフィルムをすすぐためにPBSの5ミリリットルを追加します。 </li><li>ペトリ皿からPBSを削除し、超純水でキトサンフィルムをすすぎ、それらを一晩乾燥させます。超純水を外し、プラスチック製のペトリ皿に-20℃でフィルムを保管。 </li></ol>グラフト反応の7モニタリングCEを使用しました<ol><li>すぐにセクション5.2のように分析条件を使用して、ペトリ皿から除去した後に注入し、反応媒体の別個のアリコート。 </li><li>分離が完了した後、10分間超純水でキャピラリーをすすぎます。 10分間の空のバイアル（空気）と同一平面を介して乾燥させます。 注記：この実験は、この段階で一時停止することができます。 </li></ol> 8.データトリート<html> CE用tment <ol><li>分離時の電流と（この場合はDMSO）電気モビリティマーカーの移動時間の両方がオリゴアクリレートの標準的な分離のために認められたものと類似していることを確認することにより、各分離の妥当性を確認してください。 注：最大10〜15％の変化（高い再現性が要求される場合、電気泳動移動度の値ではなく移動時間を使用する必要があります）期待される電流は約50μAの値と1.3分の移動時間値から許容可能です。 </li><li>成功した各分離のために、右の輸出をクリックして適切な信号を選択し、特定のデータセットを選択することにより、キャピラリー電気泳動ソフトウェアからの生データをエクスポートします。 </li><li> （移動時間の関数としてのUV吸光度として提示）CEによって記録された生データを変換します。式（1）以下の電気泳動移動度μにX軸（移動時間t m）を変換します。 nは1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg &quot;/&gt;（1） L dは検出器の長さであり、L tはキャピラリーの全長であり、Vは電圧であり、 そしてT EOは中性種（この場合はDMSO、内部標準）27の移動時間です。 28：Wは、（μ）は、以下の式（2）電気泳動移動度の分布に生データ（AUにおける吸光度）のY軸の変換 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54549/54549eq2.jpg" /> （2） </li></ol>ペプチドグラフトされたフィルム18の9その他のキャラクタリゼーション<ol><li>ペプチドグラフト化キトサンフィルムを挿入し、4ミリメートル固体NMRローターに、自分自身の周りに巻か。フィルムを膨潤、ロータを閉じるためにリン酸緩衝生理食塩水で回転子を埋めます。数時間待ってください。 </li><li> 13でフィルムを分析&lt;/ SUP&gt; C NMR分光法18。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ここで説明されたプロトコルのシンプルさは、広範囲のアプリケーションに、それは理想的に適しています。しかし、特に注意は、以下の重要なステップのに支払われる必要があります。 適切なCE機器の準備 日に毛細管及び機器の正当性を確認する直前に、未知試料の分離（ならびに分離の一連の終了時）に知られている標準を分離す?...

自由溶液キャピラリー電気泳動（CE）は、それらの電荷-摩擦比1.2をベースにしたソリューションにおける化合物を分離する技術です。電荷対サイズ比は、多くの場合、文献に記載されているが、この単純化は、この作品でポリペプチドを含む、高分子電解質には適用されません、また、小有機分子3に適切ではないことが示されました。 CEは、固定相のみのバックグラウンド電解質（通常は緩衝液）を有していないという点で他の分離技術とは異なります。これは、技術は合成ポリマー7の上に、このような植物繊維5、発酵ビール6グラフトなどの複雑なマトリックス4とサンプルの大規模な範囲を分析する能力に堅牢にすることができ、食品サンプル8、及び難溶性のペプチド9面倒な試料調製なしと精製。これは、溶解の問題が複雑な高分子電解質（複数の場合に特に重要ですuchがしたがって、キトサン10とジェランガム11）ととして集約された、または溶液中に沈殿が存在し、正常サンプルろ過せずに分析されています。また、朝食用シリアルのサンプルの粒子を含む試料を注入関与朝食用シリアル中の糖の分析は、水8中に沈殿させました。これはまた、分岐した高分子電解質またはコポリマー12,13の分析にまで及びます。大規模な作業はまた、特にプロテオミクス14のためのタンパク質の分析のためにCE技術の開発、天然または合成ペプチド15およびタンパク質およびペプチド16のマイクロチップ分離のキラル分離を完了しました。分離分析はキャピラリー内で行われるので、わずかな試料の体積及び溶剤は、クロマトグラフィー5,6,17を含む他の分離技術より低いランニングコストを持ってCEを可能に用いられます。 CEによる分離が速いので、monitoを可能にします反応速度のリング。これは、改善された細胞接着18キトサンフィルム上のペプチドのグラフトの場合に実証されました。 キトサンは、キチンのN個の -deacetylation由来の多糖類です。キトサンの生体適合性21、18,20 19生体接着剤および細胞増殖基質としてキトサンフィルムは、様々な生物医学的用途に使用することができます。例えばフィブロネクチン、コラーゲンおよびラミニンなどの特定の細胞外マトリックスタンパク質への細胞接着は、直接に細胞22の生存にリンクされています。特に、異なる細胞型は、多くの場合、生存および適切な機能のために、異なる細胞外マトリックスタンパク質への付着を必要とします。キトサン膜への細胞接着は、フィブロネクチン23のグラフト化によって増強されることが示されました。しかし、このような大規模なタンパク質の調製、精製及びグラフト化が経済的に実行可能ではありません。小ペプチドの交互範囲HAVeは大きな細胞外マトリックスタンパク質の特性を模倣することができることが示され。例えば、フィブロネクチン模倣体などのペプチドRGD（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）およびRGDS（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン）は、細胞接着24を促進し増加させるために使用されてきました。キトサンフィルム上へのRGDSの共有結合グラフトは、 生体内 18 でフィブロネクチンに付着することが知られている細胞のための改良された細胞付着をもたらしました。より大きなタンパク質を代入すると、同じ機能が大幅なコスト削減を提供していより小さいペプチドとフィブロネクチンが好き。 以前に18を発行し 、ここで、キトサンにグラフト化ペプチドを行いました。先に示したように、このアプローチはカップリング剤EDC塩酸（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用して簡単かつ効率的なグラフト化を提供し、NHS（Nヒドロキシスクシンイミド）とRGDSのカルボン酸を官能化するために上にグラフトキトサンフィルム。このグラフト化方法の2つの利点が、それはキトサンまたはペプチドの任意の変更を必要としないことであり、将来の細胞培養アプリケーション18,20との互換性を最大にするために、水性媒体中で行われます。カップリング剤とペプチドを充電することができるように、CEは、反応速度論の分析に適した方法です。重要なことに、CEを介して反応速度論の分析は、グラフト反応のリアルタイムモニタリングを可能にし、したがって、最適化及びグラフト化の程度を定量化の両方を可能にします。 それは日常的に必要ではないが、CE分析の結果は、共有結合グラフトを実証するために、固体NMR（核磁気共鳴）分光法25,26を用いたキトサンフィルム上にグラフト化ペプチドの直接測定によってオフラインで検証することができますフィルム18上にペプチドの。しかし、固体NMR分光法と比較して、リアルタイムに分析することによって提供さCEは、リアルタイムでのペプチドの消費量の定量化、したがって反応の動態を評価する能力を可能にします。 上記の方法は簡単であり、グラフトの程度を間接的に定量化キトサンフィルム上にグラフト化ペプチドのリアルタイム分析を可能にします。実証された方法は、長い反応物または分析されるべき製品を充電することができるように、異なる化学反応のリアルタイム定量的評価に拡張することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Water</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chitosan powder (medium molecular weight)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>448877</td>
			<td style="width:479px;">lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">2-2.5L GL</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4540</td>
			<td>laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465&#160;</td>
			<td>laboratory reagent, corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RGDS&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:119px;">H&#8208;1155</td>
			<td>peptide, bought from Auspep Pty Ltd</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D80002</td>
			<td>Irritant to skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">130672</td>
			<td>Irritant to skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>466-500G</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>384-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium hydrogen phosphate - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>1234-500G</td>
			<td>laboratory reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>4745-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Oligoacrylate standard</td>
			<td style="width:185px;">custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BDH AnalR, Merck Pty Ltd</td>
			<td style="width:119px;">10058</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">A1367-2.5L</td>
			<td>laboratory reagent, corrosivie</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fused silica tubing</td>
			<td style="width:185px;">Polymicro (Molex)</td>
			<td style="width:119px;">TSP050375</td>
			<td style="width:479px;">Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 &#181;m internal diameter, 363 &#181;m outer diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 7100 CE</td>
			<td style="width:185px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G7100CE</td>
			<td>Capillary electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">KS260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Electronic balance</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;">MS204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Milli-Q Synthesis&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZMQS5VF01</td>
			<td>Ultrapure water filtration system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Parafilm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Labtek</td>
			<td style="width:119px;">PM966</td>
			<td>Parrafin wax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis to monitor peptide grafting onto chitosan films in real time

自由溶液キャピラリー電気泳動（CE）は、電界の印加を介して溶液中の分析物、一般的に荷電した化合物を分離します。クロマトグラフィーなどの他の分析分離技術と比較すると、CEは、堅牢、安価で効果的に（複雑な自然のマトリックスまたはポリマーサンプルの数のために）何の試料調製を必要としません。分離された化合物について観察されたシグナルは、溶液中のそれらの量に正比例するようにCEは、高速かつリアルタイムで混合物の進化を追跡するために使用され得る（ 例えば 、化学反応速度論）です。 ここでは、CEの効率は、その後の生物医学的用途のためのキトサンフィルム上へのペプチドの共有結合グラフトを監視するために示されています。キトサンの抗菌性および生体適合性特性は、このような細胞増殖基質として生物医学的応用のための魅力的な材料にします。グリシン - 共有結合ペプチドRGDS（アルギニンをグラフト -アスパラギン酸 - セリン）キトサンフィルムの表面には、細胞の付着を改善することを目的とします。歴史的には、クロマトグラフィーおよびアミノ酸分析は、グラフト化されたペプチドの量の直接測定を提供するために使用されてきました。しかし、CEが提供する試料調製の高速分離と不在がまだペプチドグラフト化プロセスのリアルタイム監視を均等に正確なことができます。 （非グラフト化）ペプチドおよび化学的カップリング剤：CEは、反応混合物の異なる成分を分離し、定量することができます。このように、CEの使用は、下流の適用のための改良されたフィルムになります。 キトサンフィルムは、固体NMR（核磁気共鳴）分光法を介して特徴付けました。この技術は、より時間がかかり、リアルタイムで適用することはできないが、ペプチドの直接的な測定値が得られるので、CE技術を検証します。

CEは、キトサンフィルム上のペプチド（ 例えば 、RGDS）のグラフトの監視に適しています。適切なカップリング剤としては、キトサン上にグラフトされる（ 図1）のペプチドを有効EDC・HCl及びNHSを含みます。 CEは、反応媒体から、目的の異なる分子を分離することができます。電気泳動上のピークを割り当てるには、純粋なRGDSは、EDC-HCl及びNHSは、?...

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Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

capillary-electrophoresis-to-monitor-peptide-grafting-onto-chitosan

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.0K ビュー.  Western Sydney University. Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

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A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

テンプレート·フリー基板上に巨視的粒子 - リガンド単層フィルムを官能して自己組織化するための技術

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

化学

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

SDF-1α-キトサン硫酸デキストランナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

薄いガラス質膜のダイナミクスを決定するレート依存エリプソメトリー測定を冷却

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます<em&gt;コーヒーノキアラビカ</em&gt;種子

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Grafting Multiwalled Carbon Nanotubes with Polystyrene to Enable Self-Assembly and Anisotropic Patchiness

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a free-radical polymerization strategy to enable the modulation of the nanotube surface properties and produce supramolecular self-assembly of the nanostructures. First, a selective hydroxylation of the pristine nanotubes through a biphasic catalytically mediated oxidation reaction creates superficially distributed reactive sites at the sidewalls. The latter reactive sites are subsequently modified with methacrylic moieties using a silylated methacrylic precursor to create polymerizable sites. Those polymerizable groups can address further polymerization of styrene to produce a hybrid nanomaterial containing PS chains grafted to the nanotube sidewalls. The polymer-graft content, amount of silylated methacrylic moieties introduced and hydroxylation modification of the nanotubes are identified and quantified by Thermogravimetric Analysis (TGA). The presence of reactive functional groups hydroxyl and silylated methacrylate are confirmed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Polystyrene-grafted carbon nanotube solutions in tetrahydrofuran (THF) provide wall-to-wall collinearly self-assembled nanotubes when cast samples are analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Those self-assemblies are not obtained when suitable blanks are similarly cast from analogous solutions containing non-grafted counterparts. Therefore, this method enables the modification of the nanotube anisotropic patchiness at the sidewalls which results into spontaneous auto-organization at the nanoscale.

A procedure for the synthesis of polystyrene-grafted multiwalled carbon nanotubes using successive chemical modification steps to selectively introduce the polymer chains to the sidewalls and their self-assembly via anisotropic patchiness is presented.

ポリスチレン自己組織を有効にして異方的不均一性と多層カーボンナノ チューブを移植

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

マルチ セグメントの注入キャピラリー電気泳動質量分析法による高スループットかつ包括的な薬物監視

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動

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