ゲノム編集技術を研究することができます「編集」または特定の DNA シーケンスを変更が構成されています。これらのメソッドは、dna は、細胞が、多くの場合不完全を修復しよう小さな「カット」の作成に依存しています。この方法で科学者は古典的な遺伝子をターゲットと比較してより効率的にターゲット シーケンスの突然変異を誘発することができます。
このビデオで 3 つのゲノム編集技術の背後にある原則を確認、一方の CRISPR Cas9 システム汎用プロトコルを説明します。我々 は、これらのメソッドのいくつかのアプリケーションを探求します。
まず、ゲノム編集の背後にある原理を見てみましょう。
ゲノムの特定のシーケンスに遺伝の変更を導入するための古典的な方法は遺伝子の相同組換えによるターゲット ターゲット構造に相同の定款が変更されたバージョンの内因性遺伝子の「うちスイッチング」に 。
遺伝子をターゲットのようなゲノム編集特定の DNA 領域への変更をターゲットにできますが、それははるかに高い効率で、与えられた実験でより多くの細胞で必要な突然変異を確立すれば。
すべてのゲノムの編集方法は、酵素によって DNA に加えられた二重鎖切断を修復する細胞の能力に依存します。この損傷は非相同性末端結合または壊れた DNA の両端を直接ふさぎます NHEJ によって修理されるかもしれないまたは相同性監督の修理や HDR、相同のテンプレートからコピーすることによって、ダメージが修正されました。NHEJ は通常完璧ではない、いくつかの基地を削除されたり、ターゲット シーケンスをこのように変異修復された DNA に追加される可能性があります。一方、HDR は研究者がターゲット サイトに特定の変更を指示するテンプレートに追加することができます。
3 つの主要なゲノム編集技術を開発し、最後の数年間で大衆化されました。
1 つのメソッドで特定の転写の研究者ヒューズ DNA 結合「亜鉛指」ドメイン(fok)の DNA 切断ドメインに I 因子エンドヌクレアーゼ。亜鉛指の各ドメインには、特定塩基トリプレットが認識して、これらのドメイン人工的にリンクできます一緒にエンジニアの亜鉛指の核酸、または ZFNs ユニークな DNA シーケンスを対象とします。
同様に、核酸分解酵素「TALENs」参加(fok)と呼ばれる細菌蛋白質の変数の DNA 結合ドメインには転写活性化因子のようなエフェクタやテイルズといいます。物語の各ドメインは、単一で一意の DNA 塩基、TALENs の配列特異性を与えることを認識しています。
最後に、CRISPR Cas9 システムは、通常、ウイルスやプラスミドと同様、外国の遺伝物質によって侵入に対してホストを保護する原核生物の免疫システムのコンポーネントを使用します。このシステムで「protospacers」と呼ばれる外国 DNA 侵略部分は、転写、crRNAs と呼ばれる小さな Rna にタンパク質-RNA 機械によって処理される CRISPR 軌跡に組み込まれます。
科学者は、「単一ガイド」または哺乳類セルまたは興味の他のシステムのほぼすべての目的の遺伝子の塩基配列に Cas9 をターゲットに使用することができます sgRNA として知られている crRNA のようなガイドのシーケンスを設計することによってゲノム編集用 CRISPR 機械を利用しています。RNA シーケンス ベースの CRISPR Cas9 システムの簡単なカスタマイズは、タンパク質に基づくゲノム ZFNs と TALENs のようなメソッドの編集にはなかった利点を提供します。
ゲノム編集の背後にある原理を学んだ今、CRISPR を使用して哺乳類セルのターゲット遺伝子の変化を作成する一般的なプロトコルを確認してみましょう。
最初に、編集するゲノム位置が選択されます。この地域は、短くする必要があります-サイズ約 20 塩基-3 basepair を所有していると長い「protospacer 隣接するモチーフ」または"PAM"3 ' 端。PAM は Cas9 を認識し、ターゲット DNA 領域の切断に必要な正確なシーケンスは、生物の起源の Cas9 の使用に固有。潜在的なサイトが識別されたら、ゲノム ゲノムで似たようなサイトが他の場所で発見されていない、したがって、ターゲットをゲノム領域は編集しないことを確認するに対して検索する必要があります。
CRISPR ガイド シーケンスを合成する 2 つのオリゴヌクレオチドが生成され、同一の 1 つと 1 つのターゲット シーケンスに補足。余分なシーケンスは、sgRNA ベクトルとの互換性のための 5 ' 端に含まれています。これらのオリゴヌクレオチドが一緒に混合し、変性、および熱処理します。
次に、sgRNA「足場」を含んでいるプラスミッドを適切な制限酵素で切断して合成 CRISPR ガイド シーケンスと混合し、sgRNA 構造を作成するリガーゼの酵素の培養します。プラスミッドは細菌に変換および増幅培養できます。細菌から精製、そのゲノム編集セルに Cas9 のエンコーディングの構成要素に CRISPR コンストラクトは cotransfected。これら transfected セル栄養系コロニーを形作るに培養されます。
ゲノム DNA の各植民地から分離および PCR やシーケンスによって分析できる画面 CRISPR システムが望ましい突然変異を生産している人のために。
科学者たちは、ゲノム編集技術を使用しているいくつかの方法を見てみましょう。
多くの研究者は、ゲノム記者シーケンス特定の遺伝子座に導入する編集を使用します。この実験で ZFNs はニューロンの開発と生存に関与している遺伝子に緑色蛍光タンパク質を挿入する使用されました。研究者は、彼らは正しくニューロンに分化する幹細胞を演出 GFP および神経細胞マーカーの二重蛍光抗体法を行うことで、この遺伝子をターゲットを確認します。
ゲノム編集もそれくらい簡単になりました興味の遺伝子が機能しない表示される「ノックアウト」有機体を生成します。ここでは、研究者は mRNA は特定の遺伝子を対象とする TALENs をエンコードと胚を注入することによってノックアウト マウスを作成ましょう。TALEN 投与マウスから DNA のそれに続くエンドヌクレアーゼ治療は目標とされた遺伝子の両方のコピーに変異を持つ動物を識別するために研究者を許可しました。
最後に、ゲノムの編集は、同じ染色体領域に 2 つの二重鎖切断を引き起こすことによって大きな遺伝子欠失を作成する使用できます。遺伝子または遺伝的要素の機能は、従来のゲノムのプロトコルを編集で作成した小さな削除でノックアウトされることはできません、これらの大規模な削除必要があります。ここでは、研究者 co electroporated マウスのがん細胞に、GFP を構築し、2 つの CRISPR がん運転遺伝子内のターゲットの異なる領域を構築.GFP シグナルを出すためと、正常に導入させた細胞蛍光活性化細胞の選別、およびその後 PCR とシーケンス識別セル CRISPR 対象の 2 つのサイト間の DNA 領域が削除されましたで隔離されました。
ゲノムの編集のゼウスのビデオを見てきただけ。ここで ZFNs、TALENs の背後にある原理を確認しましたところ、CRISPR、一般 CRISPR Cas9 プロトコルを検討研究者がゲノム編集技術を今日を使用する方法を説明します。いつも見てくれてありがとう!
