この作品は no. グラント ドイツ研究振興協会 (DFG) からの財政支援で作成されましたPO413/12-1 とラ 1028/7-1。

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Uwe マルクスは社長や株主と逆流性食道炎リンドナー TissUse gmbh 社は、製造・建設技術を商業化会社の株主であります。他の著者は本稿の出版物に関する利益相反を宣言しません。

本研究は、組織構造の膜でエンジニア リングの透過特性を定量化する手法を説明します。Agarose のゲルを分子サイズが異なる物質の透過をテストおよび検証メソッドと対応するシミュレーション最初検討した.小さい分子浸透 (透過クロマトグラフィーによるゲル濾過の効果) を除いてマトリックス メッシュを速くことが知られています。似たような観測は、強膜26、ひと表皮膜27、人間の皮膚の17、およびラット皮膚28物質のサイズ排除実験で作られました。透水係数と対応するストークス半径 (説明、通常分子の有効な半径よりも小さい分子として同じ拡散速度を持つ移動剛体球の半径) の間の負の相関関係が示されています。26,28日と同様の関係は、分子サイズの異なる物質を用いた実験で観察されました。1/ストークス半径以上透水係数をプロットすることによって最小の分子サイズを 4 つのグループに線形相関が認められた (R2 = 0.93) (図 6)。これは提案法によるシミュレーションの透水係数は、現実的な範囲を示します。
実験では 46.15% のエラーはフランツ ・拡散セル システム10透水性実験の報告よりもやや大きい。1 つの可能な説明は、フルオレセイン-イソチオ シアン酸-デキストラン、後述のサイズ分布で可能性があります。
説明メソッドは利点フランツ拡散細胞システムを用いた方法と比較して重要であります。まず、セットアップがよりコンパクトです。実験は、商業のウェル プレート (∼ 13 cm × 8.5 cm) のスケールを持つ膜挿入システムで直接実行されます。別のフランツ ・拡散セルは各サンプルに必要なに対し、これにより、同時に実行する複数のサンプルです。第二に、栽培が行われる膜挿入皮膚モデルの透磁率を直接測定できます。フランツ ・拡散セルを使用して、サンプルにある撮影しは小さいサンプルのため手間がかかります、また時間がかかるシステムにマウントされています。
コラーゲン細胞マトリックスの透過実験セル シード システムにこのメソッドを正常に適用できることを示した。皮膚モデルにここに提示されたモデルを検証しましたただし、メソッドは、有機細胞培養、例えば腎臓や肝臓の他のタイプに適用できます。
本研究ではコラーゲン細胞モデルを用いて HaCaT 細胞が完全にモデルの表面をカバー (図 5参照)。これは、メソッドが HaCaT の層とコラーゲン細胞モデルと透水係数を区別するために十分に敏感であることを示す透水係数の削減につながった。理想的には、皮膚モデルは29の本当の皮膚の表皮に近づくと、バリアを構築する必要があります、したがって、実際に使用する前に皮膚モデルの質 (例えば真皮、表皮の建物) を検証する重要です。皮膚モデルの開発は、染色技術を可視化し、皮膚タンパク質とコラーゲン30,31,32の検出から定量化できます。透水係数は、皮膚モデルの開発を評価するための重要な要素もありますが、さらに、実験はこれを確認するために必要な。前述したように、このメソッドは、複数のサンプルを同時に実行できます。また、透磁率を測定し、それによって皮膚モデルのこのパラメーターの開発を観察する栽培中にサンプルを取ることが可能です。
それは、透磁率が同時にゲル/コラーゲン-セル-モデル、膜を通して測定されること注意してください。検出された透水係数は、システム固有という異なる皮膚モデルの結果のみ比較できます同じ膜挿入を使用する場合です。さらに、皮膚モデルは、モデルを介してのみ被験物質に浸透し、それに隣接していないと誘導するエラー測定透水性を確保するために全体の栽培面積をカバーする必要があります。今後の実験で考慮するべきもう一つの側面は、皮膚を取り巻く自然環境です。通常、皮膚表面の温度は透過条件に影響を与えることができます内側の地域と比較して低いです。
計算機シミュレーションと実験を配置するために応用シミュレーションにおけるパラメーター最適化を可能にする方法が発表されました。シミュレーションは、分子サイズの小さい物質の実験データとよく一致するように発見されました。ただし、シミュレーションと実験データの偏差は分子サイズの大きな物質の観察されました。大規模な多糖類分子は、摩擦を高めるし、ゲル内拡散プロセスを遅くできます。この効果により、実験間の偏差の原因である異常拡散とシミュレーション値33,34。別の説明は、フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストランの小さいまたは大きい粒子の存在可能性があります。メーカーは、特定の範囲に存在するより小さくより大きい粒子を可能にすると平均サイズとして物質の分子量を指定します。ないもどれほど分散してこれらの物質は、小さい粒子浸透ゲルと流体チャネルを介してより速くです。これらの拡散と摩擦の影響を考慮するシミュレーションを拡張することが可能です。
透過性実験とシミュレーション 2 OC で使用するため開発されました。シミュレーションの助けを借りて、この実験法より洗練された実験的設定に直接転送することができます。たとえば、膜挿入システム シミュレーションは、2 OC のジオメトリまたは同様のセットアップで他のシステムに簡単に転送できます。今後の実験の設計をサポートする変調シミュレーションのこのオプションを使用できます。また、蒸発、異常拡散膜効果などの副作用は、シミュレーションの精度を向上させる統合できます。シミュレーション プログラムは、変更または皮膚モデルの開発の他の側面を調査するために他の物理モジュールを統合するシミュレーション式を改良する機会を与えます。1 つの例は、コラーゲン細胞モデルにおけるブドウ糖の消費量と乳酸の生産のシミュレーションです。
特に興味深い医療物質のテストでは、チップ上の器官システムで物質を分散する方法です。私の助けに答える質問物質がシステムに浸透する速さなどシミュレーションと透磁率のパラメーター多 organ チップで他の組織の濃度になりますだけでなく。このメソッドは、サポートし、そのような器官のオンチップ システムを開発およびテストを強化できます。

オルガノ典型的な 3 D 培養医薬品開発とテスト1の物質の強力なツールとなっています。この点で、ヒト皮膚モデルなど、化粧品業界の規制要件により特別な関心です。彼らはその後として独自の単一器官培養ウェル プレート、または追加臓器モデル、例えば、肝2との組み合わせで多 organ チップのいずれかの使用のための多数の 3 D 皮膚モデルの開発につながっています。
肌と同等の栽培に関して気液界面 (ALI) は、適切な表皮分化3の重要な要素です。下部に液体透過性膜で容器から成る細胞文化挿入は、アリを確立する通常使用されます。ALIs は、12 ウェル (径 12.2 mm) まで表皮4Phenion5Episkin6、96 ウェル (4.26 直径 mm) からサイズの皮膚モデルの文化など市販の皮膚モデルに広く使用されています。ここで説明したメソッドは、膜挿入における物質の透過を決定します。
透水係数、培養皮膚モデルは、ネイティブの皮膚5と比較しての品質を評価する重要なパラメーターであるし、どのように迅速に評価するために使用される活性物質が皮膚を通して移行します。薬や化粧品の製品は、皮膚に適用する必要があります、特に場合は、このパラメーターは正確に活性剤がそれを通過するときに理解しておく必要。シミュレーション システムの挙動を予測し、必要な時間のかかる実験努力を減らすに助けることができるさらに、物質が関与している大口の場合は特に。
フランツ ・拡散セルは、透過実験皮膚および皮膚モデル5,6,7,8,9に芸術の状態です。このデバイスは、固定サンプル (拡散障壁) と 2 つのコンパートメントの間で構成されます。テストする物質がサンプル (ドナー コンパートメント) の上部に直接適用され、反対 (受容体) のコンパートメントに浸透の化合物の濃度を検出できます。アクセプタ側では、一定の温度と同種の物質濃度は温度チャンバー、マグネチックスターラーを保障されます。サンプルは、アクセプタ側でフランツ ・ セルのサンプリング アームから撮影することができます。179 cm と 19 cm の高さ範囲でこのシステムは比較的大きい10,11です。ゲル状物質や組織の拡散係数測定のための別の方法は、縛る。この手法の原理を使用漂白蛍光粒子ゲルと、漂白の領域の回復時間を決定するラベルの付いた拡散係数12,13,14を計算します。
さらに、皮膚15,16物質の浸透過程を決定するために、赤外光の吸光度と粒子の動きを検出するフーリエ変換赤外線 (FTIR) 分光法を使用できます。ただし、これらやその他のイメージングの方法 (例えば、2 光子蛍光相関分光法17) 集中的な楽器の費用必要があります。
この記事で手法を提案直接測定する膜挿入システム内の障壁の透過性皮膚モデルが栽培することができます。このメソッドは、小さなサンプル (よく 4.26 mm までサイズ) の数が多いとコンパクトなシステムで実行される透過性実験できます。これはフランツ ・拡散セル、別のデバイスが、デバイスにマウントするには、それぞれのプローブが必要し、小さなサンプル (4.26 mm サイズ) を実現することは困難ですのとは対照的です。さらに、メソッドは、主要なインストルメンテーション (例えば、共焦点または多光子顕微鏡) を必要としない、時間とコストの削減が達成されました。
多孔膜の実験を行ったすべては agarose のゲルまたは膜上確立されたコラーゲン細胞モデルから成るシステム サンプル (バリア) を挿入します。分子サイズが異なる蛍光物質 (ドナー) は、サンプルの上部に適用され、蛍光プレート リーダーを使用して下部 (受容体) に浸透物質の濃度が検出されました (図 1参照)。メソッドを検証し、このシミュレーションの精度をテストするために agarose のゲルが生成され、障壁として使用します。ヒドロゲルは、一般的に生物科学13多孔質媒質中の拡散と浸透のプロセスの調査のために使用されます。簡略化された皮膚モデル18,19 である一次繊維芽細胞とひと成人低カルシウム高温ケラチノ サイト (HaCaT) 細胞 (細胞マトリックス モデル)、コラーゲン マトリックスから成るセル シード システムの試験方法.
さらに、浸透プロセス フロー数値流体力学シミュレーションによるシミュレートしました。パラメーター最適化による拡散係数が実験データから計算することが分かった。一般に、このシミュレーションは、異なるアプリケーションを提供しています例えば、短い実験に基づく透過過程を予測することが可能だし、シミュレーションが実験の数を大幅に削減できます。
具体的には、2 ・ オルガン ・ チップ (2 OC) が開発市販1,22、実験とシミュレーションがオルガン オンチップ システム1,20,21にアプリケーションの設計されていた 23,24,25。原則として、膜挿入システムに基づく任意の臓器モデルの浸透プロセスはこの方法で記述することができます。

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>High Resolution Powder</td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Collagen R solution 0.4 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td><td>880010-12</td><td>High Glucose with L-Glutamine</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Fluorescein Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulated</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tablets</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 well, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>with EDTA</td></tr></tbody></table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

皮膚モデルの in vitro栽培ますます関連、製薬および化粧品用となっている物質のテストし同様、医薬品の開発にも使われて.これらのモデルは主に不可欠な要因別の物質への透過性の膜挿入システムで耕されます。通常、これらのパラメーターを決定するための応用法は、通常大規模なサンプル サイズ (例えば、フランツ ・拡散セル) または骨の折れる機器 (例えば、(FRAP) 退色後蛍光回復) が必要です。本研究は 4.26 〜 12.2 mm (栽培面積) の直径サイズの膜挿入システムに直接透水係数を決定する方法を示します。メソッドは、アガロース、コラーゲン ・ ゲル、皮膚モデルを表すコラーゲン細胞モデルと検証されました。さまざまな分子サイズと異なる細胞モデル (HaCaT、線維芽細胞は、コラーゲン ・ ゲルから成る) の透過特性を持つ物質の浸透プロセスは、正確に記述されていた。
また、上記の実験的方法をサポートするため、シミュレーションが設立されました。ストークス半径 m 14 × 10-10に分子サイズが小さい物質についても実験データにフィットまでシミュレーション (4,000 MW)、されるため、システムを記述するための有望なツール。また、シミュレーション実験努力をかなり減らすことができます、拡張またはより複雑なセットアップに適合する十分な堅牢です。

シミュレーションの精度を評価するために障壁を行った 96 ウェル膜透過実験 2% アガロースゲル システムを挿入します。フルオレセイン ナトリウム塩 (NaFl) とフルオレセイン イソチオ シアン酸メンブラン (FD) は、45 × 10-10 m ストークス半径 (376.27 40,000 mol wt) を 5 × 10-10 m から拡散物質の分子の大きさの影響を確認する使用されました。シミュレーションのネイティブのパラメーター最適化シミュレーションを実験データに合うように使用されました。
そのために、シミュレートされた透磁率の線形部分だけの斜面は実験結果と比較しました。小さい分子サイズのシミュレーションと実験データよく一致した NaFl の 99.2% と FD 4,000 80.2% (図 4 aと4 b を図参照)。大きな分子サイズには、FD の 10,000 の 50.5%、FD 20,000 の 79.7%、FD 40,000 53.6% の相関を示す高い偏差が生成されます。シミュレーションでカーブ進行を示した (図 4 c-4e参照) グラフの一層のコースの強力な上昇そして初めに遅延。
透水係数とシミュレートされた拡散係数が表示されます表 4.透過係数は分子サイズの増加と共に減少します。標準偏差は 10-8 m/s × 0.47 0.08 × 10-8 m/s とあった (N = 7)、4.18% 46.15% の間の絶対的な誤差に対応しました。大きい分子の実験は誤差の絶対値の大きいを示した。シミュレートされた拡散係数は実験的透水係数に非常に同じように振る舞った。大きなストークス半径をもつ物質減少の拡散係数と 9.09%、18.46% の間であった絶対誤差を示した (N = 3)。
追加透過実験 12 ウェルの膜でバリア挿入システム、4 つの異なるコラーゲン細胞モデル タイプが使用されました。これらのモデルは、携帯無料モデルと表面にコラーゲン ・ ゲルと HaCaT 主線維芽細胞の異なる組み合わせで細胞モデルを構成します。次の組み合わせが使用された: 携帯無料モデル コラーゲン + 線維芽細胞 (大佐 + f.) として (大佐) コラーゲン コラーゲン HaCaT (大佐 + h.) やコラーゲン + 線維芽細胞 + HaCaT (大佐 + F. + 時間)。フルオレセイン ナトリウム塩 DMEM + 10 %fcs とは、ドナーの物質として使用されました。イメージのヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色コラーゲン細胞モデルの解析が使用されました。この染色を行ったメーカーのプロトコルを使用しています。図 5代表的な大佐 + F. + H. モデルが付いているそのような汚れが表示されます。彼は、コラーゲン マトリックスの組織構造を若干汚れ。マトリックスで、繊維芽細胞がある、濃い紫の線維芽細胞と細胞の核が染色します。コラーゲン マトリックス上に HaCaTs は、モデルの上にそれを囲む層を構築の核となるべき多くの核を含む層があります。
テーブル 5、実験的透過係数とシミュレートされた拡散係数が記載されています。HaCaT なしモデルと比較してより低い浸透・拡散係数を有する HaCaT、モデルのほとんどのための傾向を見ることができます。透過係数の絶対誤差は 10.9 24.4% との拡散係数 5.2% 12.9%。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> 図 1: 膜透過性実験の側面がシステムを挿入します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> 図 2: 透過性実験の模範的なグラフ。受容体の濃度は、時間をかけて印刷されます。2 本の破線は、ほぼ線形グラフ部をブラケットします。直線部分の傾きは、透水係数を決定するために使用されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> 図 3: ジオメトリおよびメッシュ膜のシミュレーション システムを挿入します。(、) 96 ウェル膜のジオメトリの挿入システム。12 ウェル膜の幾何学 (b) 挿入システム。(c) 96 ウェル膜のメッシュ挿入システム。(d) 12 ウェル膜のメッシュ挿入システム。(e) 断面と膜のパラメーター挿入システム。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> 図 4: 透過実験から最適化シミュレーションの実験データの比較します。(e) 40,000 モル重量、(d) 20,000 モル重量 10,000 (c) mol の重量 (b) フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストラン 4,000 モル重量 (、) フルオレセイン ナトリウム塩<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> 図 5: 代表者彼のコラーゲン細胞モデル (コラーゲン + 線維芽細胞 + HaCaT) 染色します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> 図 6: 96 ウェル膜でフルオレセイン ナトリウム塩とフルオレセイン イソチオ シアン酸デキストランの使用 1/ストークス半径の関数としての透水係数は、システムを挿入します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>Mm 96 よくシステムの表現</td>
			<td>12 ウェル用 mm で発現</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14.7 [mm]</td>
			<td>井戸の直径</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>膜の直径</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>受容体の直径</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホブ</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>障壁の高さ</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>距離間も上下</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>受容体の高</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>硬度/2</td>
			<td>-</td>
			<td>浸漬深さ</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>浸漬ボール+の半径
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘイズ</td>
			<td>r + 硬度</td>
			<td>-</td>
			<td>浸漬ボール+の z 位置
</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:「化学種輸送」シミュレーションの幾何学パラメーター 。+アガロースのシミュレーション用にのみ 96 よく膜のゲルはシステムを挿入します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>式</td>
			<td>値</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Fl.So の濃度です。</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4 植物</td>
			<td>2 [mg/ml]/4000 [g/mol]</td>
			<td>0.5 mol/m 2</td>
			<td>FD 4.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml]/10000 [g/mol]</td>
			<td>0.2 mol/m 2</td>
			<td>FD 10.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml]/[g/mol] 20000</td>
			<td>0.1 mol/m 2</td>
			<td>FD 20.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml]/[g/mol] 40000</td>
			<td>0.05 mol/m 2</td>
			<td>FD 40.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^2/s]</td>
			<td>1E-9 m2/s</td>
			<td>混合水の拡散係数</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:「化学種輸送」シミュレーションの物理パラメーター。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>式</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>アクセプタ濃度の定義</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e 10</td>
			<td>D のためのフォームファクターの変更</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3:「最適化」シミュレーションのパラメーター。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>浸透</td>
			<td>透水係数 (m/s) 10-8 x</td>
			<td>拡散係数 (m/s2) x 10-10</td>
			<td>透過 (m) x 10 の-10のストークス半径</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So。</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4,000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20,000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40,000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: 別のストークス半径 2% アガロースゲル + 96 ウェル膜の膜を介して物質の透磁率と拡散係数システムを挿入します。(フルオレセイン ナトリウム塩階そう、fitc デキストランを = = FD)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>モデル</td>
			<td>透水係数 (m/s) 10-8 x</td>
			<td>拡散係数 (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐 + F。</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐 + H。</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐 + F. + H。</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 5: 12 でコラーゲン細胞モデルによるフルオレセイン ナトリウムの透磁率と拡散係数-よく膜挿入システム (大佐 = コラーゲン、f. h. 線維芽細胞を = = HaCaT).

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A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。

ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K ビュー.  Hamburg University of Technology. 膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。

ビデオ: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

がん研究

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

生物工学

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

免疫・感染学

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

免疫蛍光染色による血液脳関門モデルの解析

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

著者スポットライト:ヒト組織研究のための組織チップ技術の使用の促進 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

オープンウェルモードとマイクロ流体モードを備えたリコンフィギャラブルバリアティッシュプラットフォーム

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

著者スポットライト:ヒトバリア組織を模倣する独自のモジュール式微生理学的システムの開発

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.

静的バリア組織モデルを動的微生理学的システムに変換する

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

ウェルプレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

要約

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濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単な方法：腫瘍微小環境のミミック

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人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

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微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

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