著者は、テクニカル サポートのペギー Sirvain クリスティン Pellé とアラン ・ ペレ ヴェロニク Berardinis 有意義な議論のためにありがとうございます。

1. 酵素製剤
<ol><li>表現し、上記26として蛋白質を浄化します。 注: 次の最終濃度で組換えタンパク質が得られた: Catenulispora acidiphila、UniProtKB ID から αKAO: C7QJ42 (KDO1)、1.35 mg/mL;C. pinensis、UniProtKB ID から αKAO: C7PLM6 (KDO2)、2.29 mg/mL;S. rumirantium、UniProtKB ID から PLP Dc: O50657 (LDC下さい Srum) 12.44 mg/mL で合計酵素と無細胞抽出C. pinensis、UniProtKB ID から PLP DC: C7PLM7 (DCCpin) 2.62 mg/mL。</li>
</ol>2. 溶液の調製
注: 下すべてのソリューションは、脱イオン水用意しています。
<ol><li>HEPES 緩衝液, pH 7.5; の 1 M を準備します。水酸化ナトリウムの 5 m を調整します。 注: pH 調整手順中には、保護手袋、防護服、目の保護と顔の保護 (P280) を着用します。(P305、P351、P338) の目に接触した場合、いくつかの分削除コンタクト可能であれば水で慎重をすすいでください。洗浄を続けるし、すぐに毒センターや医師 (P310) を呼び出します。P コード予防声明を参照 (クラスやカテゴリの危険性を参照してください、例えばpubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/)。</li>
	<li>L-リジン 100 mM 100 mM (5S) の準備 - ヒドロキシ - L-リジン、150 mM の α-ケトグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム 100 mM、10 mM アンモニウム鉄 (ii) 六水和物硫酸 (モール塩)、100 mM ピリドキサール-5-リン酸 (PLP)、100 mM ジチオトレイトール (DTT)。</li>
	<li>1 M、2 M と 6 M 塩酸 (HCl) 37 %hcl 溶液 (approximatively 12 M 溶液) の 2.1 で説明したものと同じ安全手順を準備します。 注: α-ケトグルタル酸、アスコルビン酸ナトリウム、アンモニウム鉄 (ii) の硫酸塩の水和物のソリューション上で行わなければ新鮮な使用の日。リジン ソリューションは、室温で数ヶ月保存できます。PLP ソリューションは 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。DTT ソリューションは-20 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
</ol>3. 分析スケール反応
<ol><li>(5R) の脱炭酸反応法の開発 - ヒドロキシ - L-リジン<ol>
<li>HEPES バッファー pH 7.5 の 1 M 溶液 11 μ L を追加 (最終濃度 50 mM) 2 mL マイクロ チューブに。100 mM (5S) の 22 μ L を追加し、- ヒドロキシ - L-リジン (最終濃度 10 mM)、2.2 μ L 100 mM PLP の (最終濃度 1 mM)、および 100 mM DTT の 2.2 μ L (最終濃度 1 mM)。 注: LDC下さい Srumと反応、場合地デジ追加必要はありません。</li>
		<li>精製 PLP DC を追加 (最終濃度 0.1 mg/mL)。H2O の 220 μ L の最終巻を完了します。</li>
		<li>常温 3 時間 300 rpm で、オープンエアで開く蓋付き反応混合物を振る。 注: はオープンエアのオープンふた付き反応混合物を振動反応メディアの良い酸素を保証します。したがって、反応液中の酸素をバブルに必要はありません。</li>
		<li>手順 6 で説明した反応モニタリング手順に従って分析する反応液の 10 μ L を収集します。サンプルは好ましく誘導体し、サンプリング後に直接分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>触媒 αKAO 触媒 PLP DC による脱炭酸と水酸化一歩を組み合わせた酵素カスケード反応法の開発<ol>
<li>HEPES バッファー pH 7.5 の 1 M の 11 μ L を追加 (最終濃度 50 mM) 2 mL マイクロ チューブに。その後、α-ケトグルタル酸の 150 mM の 22 μ L を追加 (最終濃度 15 mM)、5.5 μ L アスコルビン酸ナトリウムの 100 mM の (最終濃度 2.5 mM)、22 μ L モールの 10 mm の塩 (最終濃度 1 mM) と L リジンの 100 mM の 22 μ L (最終濃度 10 mM)。</li>
		<li>H2O 220 μ L、3.2.3 の手順で追加する酵素液の量を考慮しての最終巻の完了します。</li>
		<li>追加対象の位置選択性によると必要な精製 αKAO 酵素: L-リジンの位置 C-4 のポジション C-3 または KDO2 水酸化の KDO1。精製酵素の最終濃度 (0.05 0.5 mg/mL) 3 h approximatively の完全な変換を有効にするために決定されました。</li>
		<li>常温 3 時間 300 rpm で、オープンエアで開く蓋付き反応混合物を振る。</li>
		<li>PLP の 100 mM の 2.2 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM) と DTT の 100 mM の 2.2 μ L (終濃度 〜 1 mM)。 注: LDC下さい Srumと反応、場合地デジ追加必要はありません。</li>
		<li>18 h: LDC の完全な変換を有効濃度に精製 PLP DC を追加下さい Srum 0.1 mg/mL KDO1、DCCpin 0.5 mg/mL のおおよその最終濃度とカスケード反応のためのおおよその最終濃度で、KDO2 連鎖反応。</li>
		<li>反応混合物を室温で 18 時間 300 rpm でオープンエアのオープンふた付き振る。</li>
		<li>3.1.4 の手順と監視作業を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ΑKAOs によって触媒 PLP DC による脱炭酸を触媒に用いる 2 つのヒドロキシル化手順を組み合わせること酵素連鎖反応法の開発<ol>
<li>3.2.1-3.2.2 の手順を実行します。</li>
		<li>最終濃度 0.05 mg/mL に KDO1 を追加します。常温 3 時間 300 rpm で、オープンエアで開く蓋付き反応混合物を振る。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に KDO2 を追加します。18 h の 300 の rpm で、オープンエアで開く蓋と、室温で反応混合物を振る。</li>
		<li>3.2.5 の手順を実行します。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に精製 PLP DC DCCpinを追加します。18 h の 300 の rpm で、オープンエアで開く蓋と、室温で反応混合物を振る。</li>
		<li>3.1.4 の手順と監視作業を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. セミ分取鍋生体触媒反応
注: 酵素反応はオープンエアの 250 mL ガラス 10 ml 容量の三角フラスコに L-リジンの 0.1 モルで遂行されます。
<ol><li>Monohydroxylated 誘導体の合成<ol>
<li>1 M HEPES 緩衝液, pH 7.5 の 0.5 mL を追加 (最終濃度 50 mM) をフラスコに加えて。100 mM L リジンの 1 mL を加えます (最終濃度 10 mM)、150 mM α-ケトグル タール酸 1 mL (最終濃度 15 mM)、100 mM アスコルビン酸ナトリウム 0.25 mL (最終濃度 2.5 mM)、10 mM モールの 1 mL の塩 (最終濃度 1 mM)。</li>
		<li>H2O 4.1.3 の手順で追加する酵素液の量を考慮し、10 mL の最終巻の完了します。</li>
		<li>追加対象の位置選択性によると必要な精製 αKAO 酵素: 最終濃度 0.5 mg/mL 位置 C-4 L リジンのための最終的な集中で C-3 または KDO2 の位置に水酸化 0.075 mg/mL で KDO1。精製酵素の最終的な集中は approximatively 3 h の完全な変換を有効にすると判断されました。</li>
		<li>適切な期間の反応混合物を室温 300 rpm で横に振る。反応の監視 (モニタリング プロトコル反応について、手順 6 の手順を実行) 完了した水酸化反応で示された 4.1.5 をステップに進みます。典型的な反応時間は、3 h です。</li>
		<li>ΑKAO 反応混合物に 100 mM PLP の 100 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM)。次に、100 mM DTT の 100 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM)、LDC下さい Srumを使用する場合を除きます。</li>
		<li>精製 PLP DC を追加: LDC下さい Srum 0.05 mg/mL の KDO1 と KDO2 と 0.5 mg/mL のカスケード反応のためのおおよその最終濃度で DCCpinカスケード反応のためのおおよその最終濃度で。</li>
		<li>18 h のための 300 の rpm、室温で反応混合物を振るし、直接 4.3 の手順で説明されている手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dihydroxylated 誘導体の合成<ol>
<li>1 M HEPES 緩衝液, pH 7.5 の 0.5 mL を追加 (最終濃度 50 mM)、100 mm L リジン 1 mL (最終濃度 10 mM)、150 mM α-ケトグル タール酸 1 mL (最終濃度 15 mM)、100 mM アスコルビン酸ナトリウム 0.25 mL (最終濃度 2.5 mM)、10 mM モールの 1 mL の塩 (最終濃度 1 mM)。H2O 4.2.2 の手順で追加する酵素液の量を考慮し、10 mL の最終巻の完了します。</li>
		<li>0.075 mg/mL の最終的な集中に KDO1 を追加します。適切な期間のための 300 の rpm で、室温で反応混合物を振る。</li>
		<li>完成した水酸化反応を示されたとき反応の監視 (モニタリング プロトコル反応について、手順 6 を参照)、4.2.5 のステップへ進みます。典型的な反応時間は、3 h です。</li>
		<li>150 mM α-ケトグル タール酸 1 mL を追加 (最終濃度 15 mM)、100 mM アスコルビン酸ナトリウム 0.25 mL (最終濃度 2.5 mM)、10 mM モールの 1 mL の塩 (最終濃度 1 mM)。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に KDO2 を追加します。反応混合物を室温 18 h 300 rpm で振る。</li>
		<li>完成したジヒドロキシ化反応を示されたとき反応の監視 (モニタリング プロトコル反応について、手順 6 を参照)、4.2.7 ステップへ進みます。典型的な反応時間は、18 h です。</li>
		<li>DTT の 100 mM の 100 μ L を追加 (最終濃度 〜 1 mM)、LDC下さい Srumを使用する場合を除きます。</li>
		<li>0.5 mg/mL、反応初期ボリュームを使用して計算の近似の最終濃度に精製の DCCpinを追加します。</li>
		<li>反応混合物を室温 18 h 300 rpm で振る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>焼入<ol>
<li>反応混合物を氷浴で三角フラスコ 250 mL ガラスを配置することによって冷やします。</li>
		<li>Approximatively 1 分、0.25 mL 手動でゆっくり冷却した反応混合物を揺することによって 6 M 塩酸の上、慎重に追加します。2.1 の手順で説明したものと同じ安全指示に従います。</li>
		<li>50 mL コニカル底遠心分離機に酸性混合管、電球、パスツール ピペット装備ガラスを使用して転送 1,680 x g と 15 分のための 4 ° C で遠心分離します。</li>
		<li>上清を撤回し、250 mL の丸底フラスコに脇を維持します。</li>
		<li>ペレットを含む円錐底遠心管に 10 mL の脱イオン水を追加します。再ペレットを中断する渦。</li>
		<li>1,680 × g で遠心分離機、4 ° C、15 分。</li>
		<li>上清を撤回し、最初の上澄み (ステップ 4.3.4) を含む 250 mL の丸底フラスコに追加。</li>
		<li>フラスコの液体窒素に浸漬による旋回、一定の手で収集した培養上清を凍結し、ベンチトップ マニホールド材料が融解するを防ぐために凍結乾燥機にすぐにフラスコを転送します。</li>
		<li>(一晩) は凍結乾燥のプロセスが完了した後、凍結乾燥機からフラスコを削除します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 粗酵素反応混合物からアミノ アルコールの精製
<ol><li>イオン交換樹脂<ol>
<li>水溶液中の 0.1 m HCl (approximatively 4 mL) の最小限のフリーズドライ製品を溶解固体粒子が肉眼に目に見えるされなくなるまで。</li>
		<li>スルホン酸の機能グループの陽イオン交換樹脂、ガラス列 (20 x 250 mm) での 200-400 メッシュを 0.1 に続いて 1 M HCl (4 列ボリューム) を大気圧下で溶出条件 M HCl (4 列ボリューム; 列ボリューム 10 mL を =)。</li>
		<li>1,000 μ L マイクロ ピペットを使用してからす柱の壁にガレージの上部に慎重にサンプルをロードします。原油製品に含まれる円錐形底遠心チューブをすすぎ 3 回 1 mL 0.1 M HCl 水溶液あたりの洗浄し、同じ方法で列に結果リンス ボリュームをロードします。</li>
		<li>非線型と溶出グラデーション: 4 列量 0.1 M HCl、水、5% NH4ああ、4 列の量 10% NH4ああ、15% NH4ああ、20% NH4オハイオの 4 列のボリュームの 4 列のボリュームの 4 列のボリュームの 4 列ボリューム、25% NH4オハイオ州および 28% NH4オハイオ州の最後に 4 列のボリュームの 4 列ボリューム。</li>
		<li>高速液体クロマトグラフィーによる精製を監視 (手順 6 を参照)。</li>
		<li>化合物 (NH4ああ 20 28%) を含有する画分をプール、4.3.8-4.3.9 の手順で説明するように凍結乾燥します。 注: イオン交換カラムは HCl の 1 M の 50 mL の溶出によって再調整によって溶出水 (50 mL approximatively) の中和に脱イオン水で溶出後再利用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>H3PO4イソブチレン (20 μ L/mL) 2 ml approximatively フリーズドライ化合物を可溶化します。</li>
		<li>抽出マニホールド上場所混在モード陽イオン交換 SPE 6 mL のカートリッジは、水ポンプに接続されています。マニホールドによって提供される減圧下でメタノール 4 mL を描画することによって、カートリッジを状態します。PO4イソブチレン (20 μ L/mL) H34 mL を描画することによってカートリッジを平衡します。</li>
		<li>上部からす柱の壁に樹脂の 1,000 μ L マイクロ ピペットを使用してカートリッジの上にサンプルをロードし、H3PO4イソブチレン (20 μ L/mL) 洗浄あたり 0.75 mL で 3 回この商品を含むバイアルをすすいでください。同じ方法で列に結果のリンス ボリュームをロードします。</li>
		<li>減圧、マニホールド、2% の 4 mL によって提供される溶出カートリッジを洗って HCOOH 4 ml の水し、水の中。NH4水のオハイオの勾配で溶出 (4% NH4オハイオ州から始まって、それぞれの溶出の 4 mL: 10%、15%、15%、20%、28%)。</li>
		<li>手順 6 で説明したプロトコルを監視する反応によると各分画を分析することによって高速液体クロマトグラフィーによる精製を監視します。紫外線 (UV) のクロマト グラムによると純粋な必要な誘導を含むすべての画分を維持し、5.2.6 をステップに進みます。</li>
		<li>プール目的を含む分数 100 mL の丸底フラスコに化合物、水、分数を含むチューブを洗浄、リンス ボリュームを 100 mL に追加丸底フラスコです。</li>
		<li>40 ° C でサーモスタットやかんお風呂装備し、10 mbar で真空ポンプに接続して回転蒸発器を用いて減圧下で溶媒を除去します。</li>
		<li>水の最小量の固体を可溶化し、重量を量られた 25 mL の丸底フラスコにソリューションを転送します。リンス水の最小量とフラスコ 25 mL フラスコにリンス ボリュームを追加して、5.2.9 のステップへ進みます。</li>
		<li>精製した製品の重量を量るし、利回りを計算します。</li>
		<li>固体粒子が肉眼に目に見えるされなくなるまで最小 2 M 塩酸の量で精製した製品を溶解し、フリーズドライの手順 4.3.8-4.3.9 で説明したよう。 注: アミノ アルコールは敏感な化合物である、その塩酸塩として保持されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 反応モニタリングや製品の分析
<ol><li>基板および高速液体クロマトグラフィー分析の前に製品の誘導体化 注: 基板や製品は芳香族誘導体の UV クロマトグラフィーによる新規を増やすと誘導体がする必要があります。1-フルオロ-2, 4-ジニトロ (DNFB) を使いました。各サンプルは、直後に誘導体化 HPLC に注入されました。<ol>
<li>酵素反応と移動の 10 μ L を 1.5 mL のマイクロ チューブにかかります。エタノールで NaHCO3水溶液の 0.25 M の 10 μ L、100 μ L のエタノールと DNFB 溶液 2.5 mg/mL の 30 μ L を追加します。</li>
		<li>したマイクロ チューブを閉じて、65 ° c、1,000 rpm で 1 h の結果のソリューションを振る。10 μ L でクエンチ HCl の 1 M。</li>
		<li>1 mL ルアーロック注射器を使用して 0.22 μ m 孔サイズ親水性ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜を 4 mm 径の非滅菌シリンジ フィルターをフィルター処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アミノ酸の誘導体を分離することができるシステムを使用して酵素反応の監視を実行します。このプロトコルには、ジニトロ (DNB) 発色団グループ27によって誘導体アミノ酸の紫外検出が含まれます。<ol>
<li>C18 と高速液体クロマトグラフィー、トリメチル シリルのエンドキャッピング逆相カラム (5 μ m、3 × 150 mm) が適してください。</li>
		<li>(無段階) 溶離液 B で C18 カラムの平衡 (MeCN + 0.1 %tfa) に溶離液 A (H2O + 0.1 %tfa) 1 mL/min と 35 ° C、15 分 (approximatively 20 列ボリュームに対応する) の流量で。</li>
		<li>誘導体の反応液の 10 μ L を注入 (手順 6.1 参照) 高速液体クロマトグラフィー C18 カラムに。MeCN、0.1 %tfa/H2O および 0.1% の混合物を使用して、線形グラデーションの溶離液として TFA (9 分、温度 35 ° C、70: 30 に比を 30: 70 の流れ 1 mL/分)。</li>
		<li>UV 検出 400 で設定を使用して、溶出クロマト グラフ列に製品を分析する nm。ドラムン ベース-リジンには約 6.5 分、水酸化ドラムン ベース-リジン約 5.5 分、dihydroxylated ドラムン ベース-リジン約 4.2 分、ドラムン ベース-aminodiol 約 5.3 分通常た。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR 分析精製アミノ アルコールの
<ol><li>D2O で精製したアミノ アルコールの溶解 (700 μ L)、核磁気共鳴 (NMR) 管にソリューションを転送。</li>
	<li>1H と13C NMR スペクトルに従って適切な NMR 施設プロトコル28を取得します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Generation+of+Biocatalysts+for+Organic+Synthesis.">New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+Organic+Chemistry+and+Biotechnology:+Past,+Present,+and+Future.">Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Turner, N. J., O'Reilly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+retrosynthesis.">Biocatalytic retrosynthesis.</a> Nat. Chem. 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Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li><li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria:+recent+achievements+and+future+perspectives.">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li><li>Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine:+A+five+carbon+diamine.">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li><li>Shin, J. H., Lee, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Classification+of+Amino+Acid+Decarboxylases+from+the+Alanine+Racemase+Structural+Family+by+Phylogenetic+Studies.">Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies.</a> Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).</li><li>Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Characteristics+of+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase+Capable+of+Decarboxylating+Both+L-Lysine+and+L-Ornithine.">Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).</li><li>Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Amino+Acid+Residues+Conferring+Substrate+Specificity+upon+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase.">Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).</li><li>H&#252;ttel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Production+of+Chemical+Building+Blocks+in+Technical+Scale+with+&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Dioxygenases.">Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with &#945;-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases.</a> Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).</li><li>Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Decarboxylation-An+Emerging+Reaction+for+Chemicals+Production+from+Renewable+Resources.">Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources.</a> ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).</li><li>Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

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光学活性アミノ アルコールおよび派生物薬物療法が有機合成光学活性助剤から、アプリケーションの広い範囲があります。従来の有機合成によるアミノ アルコールを生産するための多段階の合成は多数あるが、できない場合があります常に効率的な立体化学16の敏感な制御手順と退屈な保護・脱保護のため。保護・脱保護手順と分配するため、通常の高立体選択的生体触媒...

生体触媒によって提供される利点があるにもかかわらず合成経路や総生体触媒ルートの生体触媒のステップの統合ほとんど酵素の速度論的解像度に限られたまま。これらのルートは、不斉化学酵素合成の最初のステップとして広く使用されているが、生体触媒高立体選択性1,2,3 機能グループ相互変換でより多くの可能性を提供しています。.また、生体触媒反応は、同様の条件で行われているしたがって、ワンポット ファッション4,5で連鎖反応を実行する実行可能なは。
光学活性アミノ アルコール助剤または有機合成6の足場として使用する汎用性の高い分子である.二次代謝産物と原薬 (API)、アミノ アルコール部分は多い。主な β-アミノ アルコール類、γ-アミノ アルコール類のキラルにへのアクセスが従来の化学合成によって対応する α-アミノ酸の酸からすぐに利用できるまたは二次アミノ アルコールはしばしば一緒に敏感な退屈な合成経路を必要と立体化学7,8,9,10のコントロール。その高い立体選択性により生体触媒これらキラル11,12,13,14に優れた合成経路があります。
我々 は、ジアステレオ選択的酵素水酸化鉄 (II) の dioxygenases 触媒による合成のモノ-、ジ-ヒドロキシ-L-リシンを報告した/α-ケト酸依存性オキシゲナーゼ家族 (αKAO) (図 1)15。KDO1 ジオキシゲナーゼ L リジンから始まって、(3S) - 水酸基誘導体 (1)、(4R) - の形成を触媒する特に、デリバティブ (2)、KDO2 ジオキシゲナーゼとの反応によって形成されます。KDO1 と KDO2 によって連続 regiodivergent アントシアンが - ジヒドロキシ - L (3R, 4R) の形成につながる-リジン (3) 光学的に純粋な形で。ただし、これらの酵素の基板の限られた範囲は、アミノ基の α 位のカルボン酸残基が活動16に不可欠な化学合成、特に単純なアミンの水酸化の大規模な利用を妨げます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> 図 1: L-リジンの生体触媒変換します。(3S) への変換 - ヒドロキシ - L-リジン (1) 触媒による KDO1 ジオキシゲナーゼ;(4R) - ヒドロキシ - L-リジン (2) 触媒による KDO2 ジオキシゲナーゼ;(3R, 4R) - ジヒドロキシ - L-リジン (3) KDO1 と KDO2 dioxygenases による連続触媒カスケード反応によって。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
脱炭酸代謝17一般的な反応であります。特に、アミノ酸 Dc (EC 4.1.1) 因子無料 (pyruvoyl に依存) または PLP 依存した酵素と細菌と高い生物18,19対応するポリアミンにアミノ酸の脱炭酸を触媒します。,20,21,22. 水酸化カダベリン、L リジンの脱炭酸によって得られるジアミンに、モノとジヒドロキシ化合物 (図 3) 4-7, 10-11対応します。カダベリンは化学工業の主要なビルディング ブロック、特にそれはポリアミド、ポリウレタン高分子のコンポーネントです。したがって、再生可能な資源からこのジアミンのバイオ生産は、石油ベースのルートの代替として注目を集めているし、様々 な微生物は、この目的のために設計されています。これらの代謝経路でリジン DC (LDC) はキー酵素であります。LDC は、アラニン ラセマーゼ (AR) 構造家族23に属する PLP 依存した酵素であります。PLP 依存性 DCs (PLP Dc) は、高い基質特異的知られています。ただし、いくつかの酵素自身の子牛 rumirantium (LDC下さい Srum) から LDC の例として、L-オルニチン、L-リジンのアミノ酸の方活躍中のわずかな混乱の機能のと同様の速度定数があります。リジン、オルニチン脱炭酸24,25。この拡張の基質特異性は、この酵素のモノラル- とディ-ヒドロキシ-L-リジン脱炭酸に適して。また、リジンのヒドロキシ誘導体に向かってアクティブな Dc の発見を αKAO 酵素をコードする遺伝子のゲノムのコンテキストを検討しました。確かに、原核生物ゲノムの同じ生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子が一般的に共同でローカライズされて遺伝子クラスター。推定 PLP DC (図 2) をコードする遺伝子と共局在 ( Chitinophaga pinensis) から KDO2 遺伝子が見つかりました。これに対し、DC の遺伝子が見つかりませんでした KDO1 ジオキシゲナーゼのゲノムのコンテキストを解析するとき。PLP DC 蛋白質c. pinensis (DCCpin) からしたがって、カスケード反応の脱炭酸のステップを触媒する有望な候補として選ばれました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> 図 2: C. pinensisにおける KDO2 遺伝子のゲノム コンテキスト。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
したがって、我々 は dioxygenases とアミノ酸 (図 3) から脂肪族光学活性 β- および γ-アミノ アルコールの合成を達成するために Dc を含む酵素カスケード反応を設計されています。既報の通り、αKAO によって触媒 C H 酸化紹介合計ジアステレオ; ヒドロキシ置換ジャスモン センターCβ/γ カイラリティは、アミノ酸を有する16の先端カーボンにのみ影響 decarboxylative の手順で保持されます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> 図 3: Retrosynthetic 解析します。(A) Retrosynthesis β と γ-アミノ アルコール (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-オールの (4) (5R) - ヒドロキシ - L-リジンと (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) と 1, 5-diaminopentan-3-オール (6) からL-リジン。(B) Retrosynthesis の β、γ、β、δ-アミノ酸ジオール (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-ジオール (10) (2R4S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 4-ジオール (11) (5R) から始まって-ヒドロキシ-L-リジンと (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-ジオール (7) L リジンから始まって。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
L-リジンとその (5R) から始まって-ヒドロキシ誘導体報告 2/3 ステップ、1 つの鍋、dioxygenases とアミノ アルコールをターゲットに取得する PLP Dc 結合酵素のプロシージャ。前に合成反応条件、例えば、開始材料の完全な転換に必要な酵素の濃度を調整する分析スケールで開発されたメソッド標的分子の実験室規模でこの手順も紹介します。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-hydroxy-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>Out sourcing</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-ketoglutaric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA detector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm syringe filters - 0,22&amp;micro;m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Cation exchange resin 100-200&amp;nbsp;mesh</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>Extraction manifold</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 500 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL microtube</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL round-bottom flask 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL erlenmeyer flask</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

アミノ アルコールは、アプリケーションの広い範囲で汎用性の高い化合物です。例えば、彼らは有機合成においてキラルの足場として使用されています。従来の有機化学の合成よく立体化の結果の困難なコントロールとの退屈な多段合成プロセスが必要です。48 h ですぐに利用できる L リジンから酵素によってエレメンタリー アミノ アルコールにプロトコルを提案します。このプロトコルは、従来の有機合成による実施し非常ににくい 2 つの化学反応を組み合わせたものです。リシンの unactivated C-H 結合の最初のステップ位置、ジアステレオ選択的酸化の側鎖は; ジオキシゲナーゼによって触媒します。regiodivergent ジオキシゲナーゼによって触媒 2 番目 regio ・ ジアステレオ選択的酸化は、1, 2-ジオールの形成につながることができます。最後の手順で α アミノ酸のカルボキシルはリン酸ピリドキサール (PLP) の脱炭酸酵素 (DC) によって切断され。Decarboxylative ここだけベータ/ガンマ位置にヒドロキシ置換ジャスモン センターを維持、アミノ酸の α 炭素に影響します。結果として得られるアミノ アルコールは光学的濃縮されてしたがっています。プロトコルは、4 つのアミノ アルコールの semipreparative スケール合成に正常に適用されました。反応の監視によって実施されました高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による誘導体化後 1-フルオロ-2, 4-ジニトロ。固相抽出 (SPE) による簡単な浄化は、優れた収率とアミノ アルコールを与えられる (93% > 95%)。

ジアステレオ選択的酵素水酸化鉄 (II) の dioxygenases 触媒による合成のモノ-、ジ-ヒドロキシ-L-リシンについて報告した/16αKAO 家族 (図 1)。両方の要件を満たすために調節された反作用の状態触媒による触媒 PLP DC による脱炭酸ステップが続く、αKAO 1 つまたは 2 つの水酸化反応ステップを組み合わせると、今回紹介した全体のカス...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

光学活性アミノ アルコール足場として使用するための汎用性の高い分子は有機合成、です。ジアステレオ選択的 C-H 酸化による対応する水酸基のアミノ酸のカルボン酸残基の胸の谷間に続いてジオキシゲナーゼによって触媒を組み合わせた酵素カスケード反応によってアミノ アルコールを合成 L-リジンから始まって、脱炭酸酵素。

L リジンから光学活性アミノ アルコールの合成酵素連鎖反応

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K ビュー.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. 光学活性アミノ アルコール足場として使用するための汎用性の高い分子は有機合成、です。ジアステレオ選択的 C-H 酸化による対応する水酸基のアミノ酸のカルボン酸残基の胸の谷間に続いてジオキシゲナーゼによって触媒を組み合わせた酵素カスケード反応によってアミノ アルコールを合成 L-リジンから始まって、脱炭酸酵素。

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Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

生化学

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

酸に不安定な保護基を保持するのに適したNi-シッフ塩基錯体の使用条件の加水分解

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

イオン液体によって媒介1,6-ケトエステルの高立体選択的合成：低分子ゲル化剤の新しいクラスへの迅速なアクセスを有効にする三成分の反応

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

化学

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

チオエーテル/ビニール硫化テザー ヘリカル ペプチドによる光誘起チオール-エン/イン Hydrothiolation を構築します。

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Efficient Construction of Drug-like Bispirocyclic Scaffolds Via Organocatalytic Cycloadditions of &#945;-Imino &#947;-Lactones and Alkylidene Pyrazolones

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. Recently, we have developed an efficient organocatalytic strategy, which provides facile access to a variety of enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons. In this paper, we demonstrate a detailed protocol for the asymmetric synthesis of drug-like bispirocyclic compounds with two spirocyclic carbon centers via an organocatyltic 1,3-dipolar cycloaddition reaction. Spirocyclization synthons &#945;-imino &#947;-lactones and alkylidene pyrazolones are prepared first, which are then subjected to a cycloaddition reaction in the presence of a bifunctional squaramide organocatalyst to afford the desired bispirocycles in high yields and excellent stereoselectivities. Chiral high-performance liquid chromatography (HPLC) is carried out to determine the enantiomeric purity of the products, and the d.r. value is examined by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). The absolute configuration of the product is assigned according to an X-ray crystallographic analysis. This synthetic strategy allows scientists to prepare a diversity of bispirocyclic scaffolds in high yields and excellent diastereo- and enantioselectivities.

Enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons are asymmetrically synthesized through a simple organocatalytic 1,3-dipolar cycloaddition reaction.

効率的な薬物のような Bispirocyclic を介して α イミノ γ-ラクトンの有機触媒及び Alkylidene ピラゾロン足場の構築

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. ...

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very difficult and laborious to make aziridines in optically pure forms on a large scale to apply asymmetric synthesis of aza compounds. Fortunately, we successfully achieved both enantiomers (2R)- and (2S)-aziridine-2-carboxylates with the electron-donating &#945;-methylbenzyl group at the ring nitrogen as non-activated aziridines. These starting aziridines have two distinct functional groups-highly reactive three-membered ring and versatile carboxylate. They are applicable in ring-opening or ring-transformation with aziridine and in functional group transformation to others from carboxylate. Both of these enantiomers were utilized in the preparation of biologically important amino acyclic and/or aza-heterocyclic compounds in an asymmetric manner. Specifically, this report describes the first expedient asymmetric synthesis of both enantiomers of 5, 6-dihydrouracil-type marine natural products biemamide B and D as potential TGF-&#946; inhibitors. This synthesis consisted of regio- and the stereoselective ring-opening reaction of aziridine-2-carboxylate and subsequent formation of 4-aminoteterahydropyrimidine-2,4-dione. One more example in this protocol dealt a highly stereoselective Mukaiyama reaction of aziridine-2-carboxylate and silyl enol ether, following intramolecular aziridine ring-opening to provide easy and facile access to (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

In this study, we prepare both enantiomers of aziridine-2-carboxylate, which are used in the asymmetric synthesis of alkaloids, including biemamide B and D, and (-)-epiallo-isomuscarine.

エナンチオピュア非活性化アジリジンの調製およびビエマミドB、D、および エピアロイソムスカリンの合成

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very ...

Organocatalysis

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of organocatalysis by illustrating the proper setup of a reaction that utilizes enamine catalysis. Organocatalysis is a form of catalysis that uses substoichiometric amounts of small organic molecules to accelerate reactions. This type of catalysis is complementary to other forms of catalysis such as transition metal or biocatalysis. Transition metal catalysis involves transition metals as catalysts and biocatalysis uses enzymes as catalysts. Some advantages of organocatalysis include the low toxicity and cost of the organocatalysts in comparison to many metal catalysts. In addition, most organocatalysts are not sensitive to air and moisture, unlike metal catalysts. In contrast to enzymes found in living organisms, the small molecules that act as organocatalysts are typically easy to access. Furthermore, organocatalysis offers complementary and new reactivity not observed with other forms of catalysis.

Organocatalysis: Principles and Applications

有機触媒反応

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of ...

JoVE Science Education

有機化学Ⅱ

Acid Halides to Esters: Alcoholysis

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce esters. The mechanism proceeds in three steps:
<ol>
	<li>First, the alcohol acts as a nucleophile and attacks the acyl carbon to form a tetrahedral intermediate.</li>
	<li>Next, the carbonyl re-forms with the loss of a chloride ion.</li>
	<li>Lastly, the positively charged intermediate loses a proton to give an ester as the final product along with H3O+, making HCl an overall byproduct of the reaction.</li>
</ol>
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 200px;" />
Pyridine is used as a base to neutralize the acidic reaction mixture.
Alcoholysis of sulfonyl chlorides follows a similar pattern and forms sulfonic acid esters.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 75px;" />

酸性ハロゲン化物からエステルへ:アルコール依存症

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce ...

L リジンから光学活性アミノアルコールの合成酵素連鎖反応

要約

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