著者は、夫妻ジェニファー ヤンとアレクサンダー (サーシャ) カウフマンの多くの有用な重要な議論と同様に、この手法でテクニカル サポートをありがとうございます。血清ホルモン アッセイは、再現リガンド アッセイ研究解析コア、ユーニス · ケネディ · シュライバー NICHD/NIH (NCTRI) グラント P50 HD28934 によってサポートされているヴァージニアの大学センターで 2017 ヤンら、によって行われました。
研究支援の源: R01 NICHD 86100 (巴)、RBM T32 NICHD 007203 によって支えられました。

ここで説明したメソッドは国家機関の動物医療と使用ガイドラインに一致して、機関動物ケアとカリフォルニア大学サン ディエゴ校利用委員会によって承認されています。
1. 馴化処理
<ol><li>処理手順<ol>
<li>キャビネット、バイオ セーフティにおけるマウス ケージを配置します。ケージとバイオ セーフティ キャビネット内の適切な表面 (例えばきれいなケージ蓋) 上の場所から最初のマウスを削除します。</li>
		<li>そっと人差し指と 1 つの手の親指で尾のベースを保持することによって作業面の上にマウスを抑制します。その後、しっかりと人差し指ともう一方の手の親指で、尾の先端にベースから、尾の腹側表面をストロークします。6 回をなでるこの手順を繰り返します (すなわち1 セット) マウスをケージに戻ります。</li>
		<li>6 分待ってし、1.1.2 の手順を繰り返します。 注: 合計では、1.1.2 のステップごと繰り返されます 4 回マウス (6 ストロークのすなわち 4 セット)、それぞれのマウス処理の各日で 24 尾ストロークの合計を受信します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>毎日の処理の頻度<ol>
<li>1.1、手順 (マウスは土曜日または日曜日順化の最終 2 週間までには処理されない) 週 5 日で 2 週間前に計画された血液収集日まで 5、マウスを処理します。</li>
		<li>サンプリング期間中に実験的治療に任意の追加処理 (例えばスクラッフィングまたは腹腔内投与) を含める場合は、各処理のセッション中にこの処理アクティビティにマウスを慣らします。 注: 馴化の注入法、シャム注射を実行するのに鈍い針を使用します。</li>
		<li>前述の 1.1 では、週 7 日間計画された血液収集日の前に 2 週間の間にマウスを処理します。</li>
		<li>計画された血液収集日の前に少なくとも 2 週間のサンプリング中にマウスに混乱を最小限に抑えるためにペアでマウスを家します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 採血管の準備
<ol><li>ガラス瓶の中の超高感度 LH アッセイバッファーを準備: 0.2% ウシ血清アルブミンと 0.05% 【 0.2 g KCl、8 g, 塩化ナトリウム 1.44 g ナ2HPO4 (無水)、0.24 g KH2PO4純水 1 L、pH 7.4、フィルター、オートクレーブに PBS でトゥイーン 20、4 ° C で保存1 注: 覚悟の超高感度 LH アッセイバッファー ボリュームことができますに基づいて計算されます数のサンプルとサンプル (2.2 & ディスカッション) 下記のとおりあたりにボリューム</li>
	<li>毛細血管の血液コレクターズ (0.6 mL マイクロ遠心チューブ用) を準備します。チューブと割り切れるアッセイバッファー ラベル (57 μ L 管ごとにバッファーの注意してください、このボリュームは集められた血の量や必要なバッファーへの血液の比率に応じて異なる場合があります)。チューブは日サンプリング前準備、4 ° C で保存</li>
</ol>3. 採血
<ol><li>血のコレクションの材料の準備。<ol>
<li>用安全キャビネットを準備し、フードや近隣のカートの次の材料をアレンジ: 10 μ L ピペット (3 μ L または必要な採血量に設定)、ピペット チップ、無駄に使用されるピペット チップ、タイマー、動物数とサンプル数 (印刷の箱サンプリングまたは動物の問題についてメモ)、採血管、はさみ、小さなガーゼ (2"× 2") とバケツを氷します。 研究室のタイマーにメモ:「カウント アップ」機能役マウスを乱すことができる可聴アラームはありませんので</li>
		<li>永久的なマーカーを使用して、サンプリング中に正しいマウスの迅速な同定を支援する (麓) 各マウスの尾をマークします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>尾と前の血のコレクションの準備のクリッピング。<ol>
<li>血のコレクションの開始前に 45 分で檻から最初のマウスを削除し、バイオ セーフティ内の適切な表面 (きれいなケージ蓋がうまく) にキャビネットを配置します。</li>
		<li>シャープ、滅菌はさみを使用して次の無菌調製、鼠の尻尾の先端の 1-2 mm を削除する (すなわち、アルコールや betadine とスクラブ)。 注: これは、目を覚まし動物穏やかな拘束やイソフルラン麻酔下で実現できます。 さらに、ローカル IACUC の推奨事項に従う、鎮痛が提供されるかもしれない。</li>
		<li>前述のようにマウスの尾を慎重にストローク (1.1.2; 1-2 ストロークが一般的に十分な) 尾先端の血液のフォームの液滴まで。</li>
		<li>きれいな先端のピペットを使用して尻尾先端から 3 μ L の血液を収集、血でピペット チップを破棄します。</li>
		<li>マウスをケージに戻す前に、血流が停止したことを確認します。必要な場合は、滅菌ガーゼで穏やかな圧力を適用します。</li>
		<li>3.2.1 - すべてのマウスの 3.2.5 の手順を繰り返します。尾の先端に血液形態の水滴までしっかりとねずみのしっぽをなでるによって後続の血液サンプルを収集できます。 注: しっかりしたストローク後血液滴を形成していない、尾が生理食塩水に浸したガーゼのパッドで濃くことができます。血栓が多いフォームにそれほど頻繁にサンプリング中 (すなわち > 15 分間隔)。血栓が静脈からクリアされると、サンプリングを続行できます。</li>
		<li>各マウスはこの前採血準備期間中に約 45 分の 6 分毎に上記から 3 μ L の血液を収集し続けます。血とピペットの先端を破棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>採血<ol>
<li>前述のように尻尾先端から 3 μ L の血液を収集します。(泡の寝具汚染有無) ピペット チップに全体 3 μ L サンプルが取得できるように注意してください。ラベル付き管内アッセイバッファーに血液サンプルを取り出します。逆解析による混合し、氷にチューブを返します。</li>
		<li>マウスをケージに戻す前に、血流が停止したことを確認します。必要な場合は、滅菌ガーゼで穏やかな圧力を適用します。</li>
		<li>所定のサンプリング期間手順 3.3.1 - 6 分毎、各マウスの 3.3.2 を繰り返します。苦痛 (例えば部分的に閉じたまぶた、[その他の治療が原因でない] 背を丸めての位置または処理への応答の欠如) の印をそれぞれの動物を監視し、必要に応じてサンプリングを終了します。 注: は行動の苦痛やサンプリングの終了を必要とする他の合併、当研究室でに非常に稀に発生します。</li>
		<li>動物はない次の採血安楽死させて、尻尾先端から血流が完全に停止したことを確認します。それぞれの動物のケージ (または変更ケージ) の中からこぼれた血を拭く、ハウジング ラックに動物のケージを戻ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. サンプルの処理と解析
<ol><li>分析まで、-20 ° C で血液サンプルを格納します。 注: LH です; アッセイバッファーで希釈した全血サンプルで試金します。血清または血漿の分離はストレージや分析の前に必要ありません。</li>
	<li>超高感度 elisa 法による血液検体は上記 ng/ml の全血アッセイ バッファーのサンプル ボリュームの希釈のための補正を次の1およびレポートの値です。</li>
	<li>データ セットの LH パルスを識別します。計算し、データ セットに応じて平均パルス振幅とパルス周波数 (またはパルス間間隔) を比較します。 注意: プログラム基準13,14 15、16 LH パルスを検出するためご利用。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. , (2015).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat.">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li><li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome.">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse.">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice.">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li><li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice.">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li><li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique.">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li><li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone:+differential+suppression+by+ovarian+steroids.">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li><li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes.">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li><li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DynPeak:+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series.">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).</li><li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion.">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li><li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice.">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li><li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress.">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li><li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>. Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで全血尻尾先端サンプル マウスの拍動の LH 分泌の評価のための頻繁に血のコレクションのためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、心理社会的ストレスへの暴露に続く拍動の LH 分泌の急性変化の検出のためのサンプルの収集を有効し、LH パルスの他の急性または慢性の操作の評価に適しています。
このプロトコル LH パルスの信頼性と堅牢性のプロフ?...

哺乳類の生殖腺機能、性腺刺激ホルモン分泌、黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体からによって異なります。性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) の視床下部分泌への応答での拍動やサージ パターンで、性腺刺激ホルモンが分泌されます。合成と LH と FSH の分泌、視床下部 GnRH、生殖腺ステロイド ホルモン、アクチビン-インヒビン-フォリスタチン システムとの無数を含む分子の様々 な内分泌、パラクリンやオートクリン アクションによって規制されています。生理的ストレスとエネルギーのバランスを含みます。2
血液中の LH 拍動パターンはおよそ指数除去に続いて、末梢血に lh ではなく急激な放電から発生します。重要なパターンの各 LH 放電の頻度と LH 反応の振幅が備わって、どちらのによって決定されます、一部、視床下部下垂体門脈血の測定のための収集の難しさに GnRH。 期限のリリース拍動の GnRH、サンプリングと LH の測定は、視床下部-下垂体-性腺軸の GnRH 調節のプロキシとして使用されます。そのため、重要な情報は、周波数と振幅、LH のパルスは、1 つのサンプルからは判断できないのでエンコードされます。
LH の律動性分泌の解析とその大規模な血液量と頻繁に血液検体採取許容のための大型哺乳類 (ヒト、霊長類、羊) に限定されてきました。齧歯動物、頻繁に採血はラットに限られていたし、心房カテーテルを留置することでいます。3,4比較的低コストと遺伝の可用性 (例えばcre lox、CRISPR) し、複雑な神経回路 (例えばオプトジェネティクス、chemogenetics) 操作するマウス魅力的なモデル有機体;しかし、頻繁に血液サンプルの達成と LH 濃度の後続の分析まで最近、実証してとらえどころのないです。この記念碑的なタスクは、スタインと協力者によって開拓されました。1以来、いくつかのラボは、頻繁に採血と様々 な実験パラダイムの拍動性の LH 分泌を評価する超高感度の LH アッセイを利用し始めています。5,6,7,8,9に留意は道に沿って作った複数の改良と、少なくとも 40 年10に対して進行中のマウスから複数の血液サンプルを集めることの実用的な方法の追求がされていること。11,12
LH パルス パターン (すなわち周波数、振幅) の評価は、この遺伝的扱いの動物モデルの基底のゴナドトロピン分泌の監視の主要な改良を表します。従来、単一の血液サンプルにマウスで LH 濃度を測定しました。シングル ポイントのサンプルの 1 つの弱点は、LH 濃度は、当然のことながら各パルス中に変動非常に可変データ セット。もう一つの弱点は、孤立した測定は本質的に lh パルスのパターンによって伝えられる重要な情報を逃すことです。したがって、自由行動下で頻繁に血液サンプルを集めるための方法、気ままなマウス (サンプリング中に穏やかな処理) を除いて、拡張情報を提供し、有用性拍動性ホルモンの規則を調べる多くの研究所を。
ここでは、頻繁のコレクションのためのプロトコルについて述べる (6 分毎) 血液サンプル目を覚まし、気ままなマウスから。重要なは、我々 は、処理を含める全血試料中の拍動の LH 分泌の堅牢で連続検出は、事前および事後評価急性チャレンジにする時間の長さを決定することができますで収集できる順化プロトコルなど固定化と抑制の心理社会的ストレスに対する応答です。全血中 LH 濃度の効果的なアッセイが以前に記載されています。1この議定書は LH パルス測定のための血液サンプルを集めるための方法に焦点を当てた。

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Purified and filtered water</td></tr><tr><td>Broome Rodent Restraint Device</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

多くの内分泌システム、継続的に放出されていない循環の要因やホルモンが放出因子の応答の離散パルスとして分泌されます。シングル ポイント サンプリング対策は通常生理学的な条件の下でまたは不全の条件時に拍動性ホルモンの分泌のパターンの生物学的意義を十分に理解して適切です。黄体形成ホルモン (LH) が下垂体前葉の gonadotrope 細胞によって合成・ パルスの評価のための血液サンプルを頻繁に回収を必要とする拍動パターンで分泌されます。これは、マウスで最近まで高感度 LH 測定法の開発は、可能なされていないとの技術の進歩は、低ボリュームのサンプル コレクション、最初ジムと同僚によって記述を頻繁に。1ここで LH の律動性分泌を検出する十分な処理環境に順応マウスから頻繁に末梢血サンプルのコレクションのためのプロトコルについて述べる。現在のプロトコルは、複数時間にわたって LH の堅牢で連続パルスの評価を可能にする拡張の馴化期間を詳しく説明します。このプロトコルでは尾の先端がクリップされて、手持ちピペットを使用して尻尾からは採血します。シリアルのサンプルは、ごきぶりマウスで拍動の LH の評価のため重要なは、90-180 分に 5-6 分毎に収集血のコレクションと LH の堅牢なパルスの測定は、十分な処理を与え目を覚まし、自由行動下のマウスで行うことが順化および環境ストレスを最小限にするため。十分な馴化は、採血前に 4-5 週間以内に達成できます。このプロトコルはマウス神経内分泌研究の強力な動物モデルの複数の時間にわたって拍動の LH 分泌パターンの評価の全血試料の収集を確保するための方法論の進歩を強調表示します。

4 マウスから代表的な LH パルス パターンは、図 1 (データ転載ヤンら2017) に表示されます。LH は、急性の心理社会的ストレス チャレンジへの応答を決定するため頻繁に血液サンプルで測定しました。大人女性 C57/Bl6 マウスが卵巣摘出、頻繁に血のコレクションのこのプロトコルの詳細として処理します。LH の律動性分泌の治療前のベース?...

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Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。

拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価のためマウス尾先端採血を頻繁に

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K ビュー.  University of California, San Diego School of Medicine. ここで気ままなマウスで頻繁にサンプル コレクションの尻尾先端血液サンプリング プロトコルを提案します。このメソッドは、拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価パターンに対して有用です、他の循環要因の分析のために合わせることができます。

ビデオ: Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Modified Blood Collection from Tail Veins of Non-anesthetized Mice with a Vacuum Blood Collection System and Eyeglass Magnifier

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. The tail veins of mice are small, and it is sometimes difficult to obtain the required blood volume by conventional puncture methods. This study investigates the superiority of repeated blood sample collection from tail veins of mice through use of a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier (experimental group) compared to conventional blood sampling methods (conventional group), performed by beginners and experts, respectively. With the help of an eyeglass magnifier, a butterfly needle tip is inserted into the tail vein of each mouse in the experimental group. When the vein is penetrated successfully, a blood sample is collected in the vacuum collection tube by insertion of the rubber end of a butterfly needle into the vacuum blood collection tube. The plunger is then used to collect blood without the help of the eyeglass magnifier in the conventional group. Success rates of blood sample collection by the beginners and experts were shown to be 70% vs. 100% (p &#60; 0.01) in the experimental group and 35% vs. 85% (p &#60; 0.01) in the conventional group. For both beginners and experts, puncture times required for obtaining required blood sample were significantly lower in the experimental group compared to the conventional group (2.40 &#177; 0.75 vs. 2.90 &#177; 0.31, p &#60; 0.05; 1.15 &#177; 0.37 vs. 1.55 &#177; 0.76, p &#60; 0.05). In conclusion, the presented blood sampling technique is feasible and easy to practice and enables frequent sampling of adequate blood volumes from non-anesthetized mice.&#160;

This study reports blood sampling from tail vein in mice using a vacuum extraction tube system with eyeglass magnifier. Our method is easy to practice and could be used for repeat blood sampling in mice.

真空の血のコレクションのシステムと眼鏡拡大鏡非麻酔下マウスの尾静脈から変更された血のコレクション

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. ...

行動学

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲン マウス モデル

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

発生生物学

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects on&#160;animal well-being and can also be a confounding factor for experimental variables such as anxiety measures. Over the years, handling techniques that minimize handling-related stress have been developed with a particular focus on rats, and little attention to mice. However, it has been shown that mice can be habituated to manipulations using handling techniques. Habituating mice to handling reduces stress, facilitates routine handling, improves animal wellbeing, decreases data variability, and improves experimental reliability. Despite beneficial effects of handling, the tail-pick up approach, which is particularly stressful, is still widely used. This paper provides a detailed description and demonstration of a newly developed mouse-handling technique intended to minimize the stress experienced by the animal during human interaction. This manual technique is performed over 3 days (3D-handling technique) and focuses on the animal&#39;s capacity to habituate to the experimenter. This study also shows the effect of previously established tunnel handling techniques (using a polycarbonate tunnel) and the tail-pick up technique. Specifically studied are their effects on anxiety-like behaviors, using behavioral tests (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), voluntary interaction with experimenters and physiological measurement (corticosterone levels). The 3D-handling technique and the tunnel handling technique reduced anxiety-like phenotypes. In the first experiment, using 6-month-old male mice, the 3D-handling technique significantly improved experimenter interaction. In the second experiment, using 2.5-month-old female, it reduced corticosterone levels. As such, the 3D-handling is a useful approach in scenarios where interaction with the experimenter is required or preferred, or where tunnel handling may not be possible during the experiment.

This paper describes a handling technique in mice, the 3D-handling technique, which facilitates routine handling by reducing anxiety-like behaviors and presents details on two existing related techniques (tunnel and tail handling).

マウスのストレスを軽減する取り扱い技術

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

生物学

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

マウスの鎖骨下静脈穿刺による血液採取

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

医学

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

マウスにおける全身脂質処理能力の評価

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

DREADDs技術と自動採血

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

著者スポットライト:意識のあるマウスにおける正確なホルモン分析のための自動注入と採血

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

マウスの循環黄体形成ホルモンを誘導および測定するための自動採血と組み合わせた遠隔ニューロン活性化

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価のためマウス尾先端採血を頻繁に

要約

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真空の血のコレクションのシステムと眼鏡拡大鏡非麻酔下マウスの尾静脈から変更された血のコレクション

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲンマウスモデル

マウスのストレスを軽減する取り扱い技術

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

マウスの鎖骨下静脈穿刺による血液採取

マウスにおける全身脂質処理能力の評価

ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

マウスの循環黄体形成ホルモンを誘導および測定するための自動採血と組み合わせた遠隔ニューロン活性化

マウスの循環黄体形成ホルモンを誘導および測定するための自動採血と組み合わせた遠隔ニューロン活性化

拍動性の黄体形成ホルモンの分泌の評価のためマウス尾先端採血を頻繁に

要約

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真空の血のコレクションのシステムと眼鏡拡大鏡非麻酔下マウスの尾静脈から変更された血のコレクション

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲン マウス モデル

マウスのストレスを軽減する取り扱い技術

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

マウスの鎖骨下静脈穿刺による血液採取

マウスにおける全身脂質処理能力の評価

ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

マウスの循環黄体形成ホルモンを誘導および測定するための自動採血と組み合わせた遠隔ニューロン活性化

マウスの循環黄体形成ホルモンを誘導および測定するための自動採血と組み合わせた遠隔ニューロン活性化

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲンマウスモデル