この作品は、Guozhou の徐のノースカロライナ州立大学から新しい学部スタートアップ資金によって支えられました。

注: 分泌植物蛋白発現および結晶化のための変更された表現のベクトルとバキュロ昆虫細胞システムが使用されます。
1. 植物タンパク質分泌発現の GP67 シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更
<ol><li>5' BglII 切断サイト13GP67 の分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 a) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。 注: BglII と病原が消化されるので同じ接着端で起因した DNA、焼なまし結紮順番 BglII と病原の両方のサイトは、劈開はシーケンスに変異が、一直線に並べられたベクトルが消化の DNA のフラグメントを縛ることができます。BglII または病原14。</li>
	<li>BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI14発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。<ol>
<li>摘出した DNA のフラグメントそして DNA ゲル抽出キット15によって一直線に並べられたベクトル DNA を浄化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファー (50 mM 10 mM DTT、1 mM ATP、10 mM MgCl2トリス塩酸 pH 7.5 25 ° c) および T4 DNA の 5 単位 × 1 を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物にリガーゼ。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。5-10 コロニーをピックアップし、220 rpm、16 h のため振動のインキュベーターで 37 ° C で 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地 2 mL の各植民地の成長します。</li>
	<li>DNA の miniprep キット17各プラスミド DNA を抽出し、AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG のプライマーと DNA の配列によってクローンを確認します。</li>
	<li>PCR 増幅シロイヌナズナTDR 遺伝子フラグメントのエンコーディング残 30-642 合成 TDR 遺伝子から構築 (プライマーを転送: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC、逆プライマー: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC)。30 サイクル 0.5 mM dNTP ミックス、0.2 μ M プライマー、テンプレート DNA の 0.1 μ g、0.4 mM MgCl2、および DNA ポリメラーゼの反応 1式を含む DNA ポリメラーゼ反応バッファー内の DNA を増幅します。<ol>
<li>PCR のサイクルのステップの設定初期変性 95 ° C、30 s、および 30 の変性 95 ° c、30 サイクル s、30 s、や 72 ° c 1 分、72 ° C、5 分で最後の拡張と拡張機能のための 55 の ° C で熱処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR のフラグメントと制限の endonuclease 酵素ノッティと病原を変更されたベクトルを消化します。一直線に並べられたベクトルを持つ遺伝子のフラグメントを縛る。400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファーと T4 DNA リガーゼの 5 単位を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物に。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。DNA の配列によって正しいクローンを確認します。</li>
</ol>2. 植物タンパク質分泌発現の昆虫ヘモリン シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更
<ol><li>5' BglII 切断サイト13、昆虫ヘモリン分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 b) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。</li>
	<li>BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI14発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。<ol>
<li>摘出した DNA のフラグメントそして DNA ゲル抽出キット15によって一直線に並べられたベクトル DNA を浄化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファー (50 mM 10 mM DTT、1 mM ATP、10 mM MgCl2トリス塩酸 pH 7.5 25 ° c) および T4 DNA の 5 単位 × 1 を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物にリガーゼ。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>結紮の混合物の 5 μ L を DH5α 有能なセルの 100 μ L に変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート上のコロニーを選択します。5-10 コロニーをピックアップし、2 mL LB 培 220 rpm、16 h のため振動のインキュベーターで 37 ° C でアンピシリンの 100 μ g/mL の各植民地の成長します。</li>
	<li>DNA の miniprep キット17プラスミド DNA を抽出し、AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG のプライマーと DNA の配列によってクローンを確認します。</li>
	<li>合成 PRK3 遺伝子構造から残 20-237 をエンコーディング花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3) PCR 増幅シロイヌナズナ遺伝子フラグメント (プライマーを転送: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC、逆プライマー: シージーシー GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTGTGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)。30 サイクル 0.5 mM dNTP ミックス、0.2 μ M プライマー、テンプレート DNA の 0.1 μ g、0.4 mM MgCl2、および DNA ポリメラーゼの反応 1式を含む DNA ポリメラーゼ反応バッファー内の DNA を増幅します。<ol>
<li>PCR のサイクルのステップの設定初期変性 95 ° C、30 s、および 30 の変性 95 ° c、30 サイクル s、30 s、および 30 のための 72 ° C で拡張子 55 ° C で熱処理各サイクルと 72 ° C、5 分で最後の拡張内にある s。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR のフラグメントと制限の endonuclease 酵素ノッティと病原を変更されたベクトルを消化します。一直線に並べられたベクトルを持つ遺伝子のフラグメントを縛る。400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファーと T4 DNA リガーゼの 5 単位を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物に。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。DNA の配列によって正しいクローンを確認します。</li>
</ol>3. 生産とバキュロ ウイルスの増幅を構築組換え蛋白質発現カセットをかくまっています。
<ol><li>バキュロ ウイルス発現システム1のプロトコルに従う DH10Bac 有能なセルの 40 μ L を変換する構成体プラスミドの使用 100 ng。48 h の 37 ° C で変換プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>各変換プレートから 2 つの白いコロニーをピックアップし、各植民地を 50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 μ G/ml テトラサイクリンを含む LB 培地 2 mL に接種します。抽出し、DNA バクミドを確認するバキュロ ウイルス式システム1のプロトコルに従ってください。分注、それぞれ 20 μ L と 2 つの管で各 DNA、-20 ° C でチューブを格納 注: 次の手順では、無菌操作を必要があります。</li>
	<li>6 ウェル プレートで 80% 合流に 27 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質 Sf9 細胞の単分子膜を成長します。組織培養プレートのカバーされている領域の割合に基づく合流点の割合を推定します。</li>
	<li>2 滅菌 1.5 mL 遠心チューブに以下のソリューションを準備します。<ol>
<li>チューブ 1: 各 transfection のため抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 100 μ L に DNA バクミドの 20 μ L を希釈します。管の側をフリックで希釈を優しく混ぜます。</li>
		<li>チューブ 2: 各 transfection のため、抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 100 μ L に脂質のトランスフェクション試薬の 8 μ L を希釈します。6 x の上下にピペッティングによる希釈を徹底的にミックスします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 つのソリューションを組み合わせて、3 x、上下にゆっくりとピペッティングで優しくそれらをミックスし、室温で 20 分間インキュベートするそれら。</li>
	<li>Sf9 単層の細胞 2 倍の抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 3 mL で洗う。各 transfection のため脂質 DNA の混合物を含む各チューブに培 Sf9 細胞培養液抗生物質なしの 0.8 mL を追加します。軽く 3 倍のアップとダウンゆっくりとピペッティングによるチューブの内容をミックスします。プレートから洗浄メディアを吸引し、トランスフェクション混合物サンプルを重ねてください。</li>
	<li>トランスフェクション混合物の付加の後で 27 ° C で 5 h 用 transfected プレートを孵化させなさい。トランスフェクション メディアを交換して 10 %fbs と 100 μ g/mL (またはリンパ) を含む、完全な Sf9 細胞培養培地に抗生物質ペニシリン-ストレプトマイシン。4 d のための 27 ° c transfected プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>収穫し、組換えバキュロ ウイルスを増幅します。<ol>
<li>インキュベーションの 4 d の後滅菌 15 mL の円錐管に感染したプレート上澄みを収集します。1010 x g細胞の残骸を削除する 5 分で上清をスピンします。ペレットを破棄し、クリーン チューブに上清をデカント 4 ° C で 1 年間保存します。 注: これは P0 ウイルスです。それは時間の長い期間のため避けようと-80 ° C で保存されますをすることができます。</li>
		<li>各遺伝子組換えウイルスを増幅するには、150 mm 板上 Sf9 細胞の単分子膜を 80% 合流に成長します。プレートからメディアを吸引 P0 ウイルスの 2 mL をプレートに付着性のセルに追加して、27 ° C の定温器で 1 時間版を孵化させなさい。細胞と培地を混合するプレート 15 分毎をロックします。<ol>
<li>25 ml 10 %fbs と 100 μ g/mL (またはリンパ) を含む完全な恵みのメディアのペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質。P1 通路ウイルスを入手して 27 ° C の定温器で 3 d 版を孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>滅菌 50 mL の円錐管と 1010 x g細胞の残骸を削除する 5 分でスピンで感染したプレート上澄みを収集します。クリーン チューブに上清をデカント、4 ° C で 1 年間保存できます。 注: P1 ウイルスは、時間の長い期間のため、避けようと-80 ° C で保存されますを使用できます。</li>
		<li>P1 から P2 通路にウイルスを増幅するには、90% 合流する 150 mm 板上 Sf9 細胞の単分子膜を成長、プレートのメディアを吸引、プレート、P1 ウイルスの 2 mL を追加、27 ° C の定温器で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>3.8.2 と 3.8.3 ウイルスの P2 と P3 の通路を取得する手順を繰り返します。2 ヶ月以上 P3 ウイルスを格納しないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 蛋白質の表現、NiNTA、および結晶化で精製
<ol><li>1 L 27 ° C インキュベーター シェーカーで 100 rpm で 2 × 106の密度を 100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質の Hi5 昆虫細胞の文化します。570 x gで 5 分で細胞をスピン、上清をデカント、20 ml たて作り出された P3 ウイルスの細胞を再懸濁します、1 h. そっと振って 15 分毎 × 1 細胞を再懸濁しますスピン ボトルの部屋の温度でそれを維持します。</li>
	<li>100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質の 1 L にセルを転送、1,010 × gで 5 分で細胞を 72 h スピンの 27 ° C インキュベーター シェーカーで 100 rpm で細胞の培養上清を収集します。</li>
	<li>使用 pH インジケーター ストリップ 0.1 M HCl または 0.1 M NaOH を追加して 8.0 上澄みの pH を調整し、最終的な濃度、ph 8.0、100 mM の NaCl、Tris バッファーは 20 mM と 5 mM のイミダゾールを含む結合バッファーを追加します。表現彼タグ組換えタンパク質の推定収量に基づく NiNTA 樹脂 (10-40 mL)、一定の量を追加します。<ol>
<li>樹脂 1 h. 洗浄のための 4 ° C で低速で電磁攪拌のソリューションをミックスし、次の標準的な NiNTA の浄化のプロトコル18バインドされた蛋白質を溶離する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イオン交換精製タンパク質とゲル濾過クロマトグラフィーとして同質なサンプルを生成するための他の蛋白質の浄化方法。 注: TDR 外部ドメイン、20 mM トリス、pH 8、100 mM の NaCl はゲルろ過バッファーとして使用されました。PRK3 外部ドメイン、20 mM ビス-トリス、pH 6、100 mM の NaCl は最寄りのゲルろ過バッファーとして使用されました。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system.">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).</li><li>Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+3a+protein+and+the+assembly+of+coronavirus-like+particles+in+the+baculovirus+expression+system.">Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system.</a> Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).</li><li>Possee, R. D., King, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+Transfer+Vectors.">Baculovirus Transfer Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).</li><li>Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+two+cell+lines+from+the+insect+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera;+Noctuidae).">The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae).</a> In Vitro. 13, 213-217 (1977).</li><li>Hink, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+insect+cell+line+from+the+cabbage+looper,+Trichoplusia+ni.">Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni.</a> Nature. 226, 466-467 (1970).</li><li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines.">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).</li><li>Wickham, T. J., Nemerow, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+growth+methods+and+recombinant+protein+production+in+BTI-Tn-5B1-4+insect+cells+using+the+baculovirus+expression+system.">Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system.</a> Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).</li><li>Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+of+alkaline+phosphatase+as+a+reporter+gene+for+evaluation+of+production,+glycosylation+and+secretion.">Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion.</a> Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).</li><li>Murphy, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression,+secretion,+and+large-scale+purification+of+recombinant+HIV-1+gp120+in+insect+cell+using+the+baculovirus+egt+and+p67+signal+peptides.">Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides.</a> Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).</li><li>Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolin:+an+insect-immune+protein+belonging+to+the+immunoglobulin+superfamily.">Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily.</a> Science. 250, 1729-1732 (1990).</li><li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+CLE+peptide+perception+by+plant+receptors+implicated+from+structural+and+functional+analyses+of+TDIF-TDR+interactions.">Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions.</a> PLoS One. 12, e0175317 (2017).</li><li>Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Domain+of+Pollen+Receptor+Kinase+3+is+structurally+similar+to+the+SERK+family+of+co-receptors.">The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors.</a> Scientific Reports. 8, 2796 (2018).</li><li>Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+gene.">Total synthesis of a gene.</a> Science. 203, 614-625 (1979).</li><li>Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+inserting+specific+DNA+sequences+into+cloning+vehicles.">A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles.</a> Gene. 1, 81-92 (1976).</li><li>Xu, W., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Vaccine-Derived+Polioviruses,+Relevance+for+the+Global+Polio+Eradication+Initiative.">Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative.</a> Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Reddy, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+alpha+subunit+of+the+epithelial+sodium+channel,+ENaC.">Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC.</a> Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).</li><li>Harris, T. J., Emtage, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+heterologous+genes+in+E.+coli.">Expression of heterologous genes in E. coli.</a> Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).</li><li>Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+heterologous+protein+expression+in+E.+coli:+Roadblocks+and+reinforcements.">Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements.</a> International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).</li><li>Guo, Y., Yang, F., Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Protein+Secretion+in+Yeast+and+Animal+Cells.">An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).</li><li>Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+secretion+pathway+in+Escherichia+coli.">Protein secretion pathway in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).</li><li>Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+protein+secretion+in+yeast:+strategies+and+impact+on+protein+production.">Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).</li><li>Wormald, M. R., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteins:+glycan+presentation+and+protein-fold+stability.">Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.</a> Structure. 7, R155-R160 (1999).</li><li>Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+and+History+of+Glyco-Engineering+in+Insect+Expression+Systems.">An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems.</a> Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).</li><li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor,+DORN1,+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa.">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li><li>Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+hydrophobin-assisted+recombinant+protein+production+in+tobacco+BY-2+suspension+cells.">Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells.</a> Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).</li><li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells.">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

サイズおよび生物学的システムで現在の蛋白質の何千もの安定性の多様性を考えると、それは実証研究のためはしばしば特定の蛋白質の表現のために選択される異種発現システムを決定する室します。大腸菌発現系は多くの場合19をスケール アップする細菌は、低コストの文化、メディアおよび相対的な容易さの短いライフ サイクルのための蛋白質の表現のための最...

特に x 線結晶構造解析のための生化学的および生物物理学的特性の均質な組換えタンパク質の大量生産ができるように研究所が不可欠です。大腸菌酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞などそれらの間など定評の異種発現系が多い、バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、ほとんどの一つです。構造的に折り畳まれた大型真核生物に向けた組換えタンパク質タンパク質結晶化1の大量に生産するのに技術が使用されます。
バキュロ ウイルス発現系の表現のベクトルは、強い由来ポリヘドリン遺伝子または遺伝子組換え細胞内タンパク質2,3の高収率を生成する P10 プロモーターを含む設計されています。組換えバキュロ ウイルスをするためには、興味の遺伝子が違いによるとマルチ nucleopolyhedroviral ゲノム由来ポリヘドリン遺伝子 (polh) の軌跡を含む昆虫ベクトルに複製されます。結果としての構築は、シーケンシャルなその正しいオープンリーディング フレーム (ORF) が確認されます。正しいコンストラクト トランスフェクションのプロセスを介して宿主昆虫細胞に導入します。興味の遺伝子は相同組換えによってウイルスのゲノムに挿入されます。このイベントは、組換えウイルスのゲノムは、組み換え体を生成するが、複製が芽生えてウイルス粒子1の生産の結果します。
昆虫細胞発現系において最も一般的に使用される、Sf9 と高の 5 (Hi5) セルです。Sf9 細胞 Sf21、ハスモンヨトウの frugiperdaの蛹卵巣細胞由来のクローンの分離、Hi5 細胞クローン分離親Trichoplusia ni卵巣細胞ライン TN 3684,5から派生しました。Sf9 細胞の共同 transfections、ウイルスの増幅、およびプラクの試金を実施する Hi5 細胞が通常より高い組換えタンパク質6量を生成する選択されています。変異ウイルスを生成する傾向があるため、Hi5 細胞を世代ウイルス後代の増幅に適してない注目に値するです。従来は、25-30 ° C の温度範囲は、昆虫細胞の培養に適していると見なされます。ただし、27 ~ 28 ° C が昆虫の細胞の成長および感染症7,8の最適な温度であることが報告されています。
分泌されるタンパク質の高発現遺伝子の前強い信号系列の導入が必要です。効率的に信号シーケンスは翻訳された組換えタンパク質を小胞体タンパク質の分泌と適切な折り畳みと安定化3に必要な翻訳後修飾に導きます。信号ペプチド配列、バキュロ ウイルスを包む蛋白質 GP64/67、ミツバチ メリチンなどなどバキュロ ウイルスによる発現システム3分泌遺伝子組換え蛋白質の発現を促進するのに選択されています。GP67 のシグナルペプチドの導入は、ターゲット遺伝子9の内因性信号のペプチッドを使用と比較して、分泌の組換え蛋白質の表現の収量を改善するために示されています。ヘモリン細菌感染10時に誘起される巨大な絹蛾Hyalophora 丹野、皓三の体液蛋白質であります。誘導式の比較的高レベルによるバキュロ ウイルス昆虫細胞における組換えタンパク質の分泌発現を仲介する遺伝子の信号のペプチッド シーケンスを使用できます。
シロイヌナズナ管状要素分化抑制因子受容体 (TDR) と両方蛋白質11,12 の植物ロイシン豊富な繰り返し受容体様キナーゼ (LRR RLK) の家族に属している花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3).構造と植物受容体タンパク質も他の植物の分泌タンパク質の構造および生化学的解析が容易になるのこのファミリーの機能を研究するためにバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系に変更されています蛋白質の品質と生産の収量を向上させます。TDR と PRK3 の両方の細胞外ドメインは、バキュロ ウイルス昆虫細胞発現系の 2 つの変更された表現のベクトルを使用して正常に表現されています。TDR と PRK3 蛋白質の両方の細胞外ドメイン、結晶化されています。この記事は、GP67 またはプロモーターと複数クローン間ヘモリン信号シーケンスのいずれかを組み込むことによって式と 2 つの変更されたバキュロ ウイルス発現ベクターで遺伝子組換え分泌植物タンパク質の大量精製を報告します。サイト。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model Excella E25</td>
			<td>27 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 2005</td>
			<td>27 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>Model J-6</td>
			<td>with a swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677-51</td>
			<td>For PCR amplification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Model C1000 Touch</td>
			<td>For PCR amplification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model I 24</td>
			<td>For growing baceria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customer DNA synthesis</td>
			<td>GENSCRIPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI (HF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI (HF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>DNA ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>DNA purification from Agorase gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>Plasmid DNA purification from bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15510-019</td>
			<td>For DNA gel electropherosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAX Efficiency DH5&#945; competen cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18-258-012</td>
			<td>For transformation of DNA ligation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox L LB Broth</td>
			<td>Research Product International Corp.</td>
			<td>L24066-5000.0</td>
			<td>For making bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11593-019</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15160-054</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAX Efficiency DH10Bac competent cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10361-012</td>
			<td>For making bacmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544-034</td>
			<td>For DNA transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellFECTIN II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362-101</td>
			<td>Insect cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Baculovirus-insect cells expression kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-gal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>For isolation of recominant Bacmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15529-019</td>
			<td>For isolation of recominant Bacmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10360014</td>
			<td>Baculorirus expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 monolayer cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi5 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>High Five insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s insect medium, unsupplemented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11595030</td>
			<td>Sf9 cell transfection minimum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s insect medium, supplemented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11605102</td>
			<td>Sf9 monolayer cell culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 II SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10902104</td>
			<td>Sf9 suspension cell culture medium without FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Five SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10486025</td>
			<td>Hi5 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 ml (10,000 I.U./ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Certified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Flat-bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>353025</td>
			<td>100/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td>500 tubes/bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical screw cap centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0511</td>
			<td>25 tubes/bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical screw cap centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td>25 tubes/bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td>NiNTA resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator strips</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>1.09535.0001</td>
			<td>pH 0 - 14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modifying baculovirus expression vectors to produce secreted plant proteins in insect cells

真核生物遺伝子組換え分泌蛋白質構造および生化学的研究を表現する科学者のための挑戦だった。バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、いくつかの翻訳後修飾遺伝子組換えの真核生物の分泌蛋白質を表現するために使用するシステムの一つです。分泌タンパク質は、タンパク質の糖鎖修飾、ジスルフィド結合の形成および他のポスト翻訳の修正の分泌経路を介してルーティングされる必要があります。既存昆虫細胞分泌植物タンパク質発現を高めるためには、バキュロ ウイルス発現ベクターは GP67 のいずれかの追加またはプロモーターと多重クローニング サイトの間ヘモリン信号のペプチッド シーケンスによって変更されます。この新設計変更されたベクトル システムは、シロイヌナズナの可溶性組換え分泌植物受容体タンパク質の高収率に成功しました。X 線結晶学的研究 2 発現植物タンパク質、シロイヌナズナ TDR と PRK3 の細胞膜受容体の細胞外ドメインの結晶化しました。変更されたベクトル システムは動物の王国と同様に組換え分泌蛋白質の表現の可能性のある使用できる改良されたツールです。

図 1に示すように、GP67 またはヘモリン信号シーケンスのいずれかの標的遺伝子の組み込み信号シーケンスに置き換えると分泌された蛋白質を表現する 2 つの変更された pFastBac1 バキュロ ウイルス発現ベクターが使用されました。ウイルス GP67 と昆虫ヘモリン遺伝子は、細胞の高い分泌発現レベルに実証されています。これらの 2 つの信号シーケ...

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Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

modifying-baculovirus-expression-vectors-to-produce-secreted-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.4K ビュー.  North Carolina State University. ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。

ビデオ: Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

生化学

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells and protein ensembles. Thus far, no method has been available to quantify in bulk and in live cells how many of the PA-FPs expressed are photoactivated to fluoresce.
Here, we present a protocol involving internal rulers, i.e., genetically coupled spectrally distinct (photoactivatable) fluorescent proteins, to ratiometrically quantify the fraction of all PA-FPs expressed in a cell that are switched on to be fluorescent. Using this protocol, we show that different modes of photoactivation yielded different photoactivation efficiencies. Short high-power photoactivation with a confocal laser scanning microscope (CLSM) resulted in up to four times lower photoactivation efficiency than hundreds of low-level exposures applied by CLSM or a short pulse applied by widefield illumination. While the protocol has been exemplified here for (PA-)GFP and (PA-)Cherry, it can in principle be applied to any spectrally distinct photoactivatable or photoconvertible fluorescent protein pair and any experimental set-up.

Here, we present a protocol that involves genetically coupled spectrally distinct photoactivatable and fluorescent proteins. These fluorescent protein chimeras permit quantification of the PA-FP fraction that is photoactivated to be fluorescent, i.e., the photoactivation efficiency. The protocol reveals that different modes of photoactivation yield different photoactivation efficiencies.

センサー蛍光蛋白質生きているセルおよびバルク量を定量化する方法

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。

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植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

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植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。