この方法は、真菌と哺乳類の違いを分子レベルで明らかにするのに役立ちます。このような違いは、新しい治療アプローチを特定するために活用することができます。この技術の主な利点は、古典的な相同組換え技術よりもC.Albicansのゲノムをより効率的に改質することです。
ガイドRNA配列を同定するために、停止コドンが挿入される場所に近いNGG PAM配列を同定する。ここに示されている、TPK2の最初の100塩基対に見られるすべてのPAM配列は、環状AMPキナーゼ触媒サブユニットである。フォワードガイドプライマーを3つのシーケンスで識別します。
このシーケンスは、NGG PAMサイトの直接上流20基となり、5つ以上のTを連続して含みません。NGGの直接上流のベースを左クリックし、カーソル20基をドラッグします。次に、プライマー タブをクリックしてプライマーを追加します。
さて、前方ガイドシーケンスへの賛辞となる逆ガイドプライマー3つのシーケンスを特定します。NGGの直接上流のベース上で左舐め、カーソル20基をドラッグします。各プライマーについて、プライマー タブを左クリックしてプライマーを追加します。
プライマーを右クリックし、プライマー データのコピーを選択します。テキスト編集プログラムにシーケンスを貼り付けます。オーバーハングシーケンスをフォワードおよびリバースガイドオリゴに追加して、クローニングを容易にします。
順導プライマー3の5つの素端に塩基配列ATTTGを加え、順導プライマー3の3つの素端にGを加える。最後に、逆ガイドプライマー3の5つの素端に塩基配列AAAACで、Cを購入前に逆ガイドプライマー3の3つの素端に加える。色素は、pv1524、10xバッファー、bs9b1、および水を1.5ミリリットルチューブの50マイクロリットルに加え、摂氏55度で20分間インキュベートすることにより、Candida最適化cas9発現ベクターをテストします。
消化混合物を室温まで冷却し、Gの2348倍で30秒間回転させ、チューブの底に結露させます。ホスファターゼは消化された骨格を治療するために、消化混合物に子牛腸ホスファターゼの1マイクロリットルを加える。反応を摂氏37度で1時間前にインキュベートします。
ここで、リン酸化及びアニール前方ガイドプライマー3と逆ガイドプライマー3は、これらを10xT4リガーゼバッファー、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、およびPCRチューブ内の水と組み合わせることにより。10x T4リガーゼバッファー、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、分子生物学グレード水を第2のPCRチューブに陰性制御として加えます。サーモサイクラーで37°Cで反応混合物を30分間インキュベートし、その後摂氏95度で5分間インキュベートします。
最も遅いランプレートで混合物を16°Cに冷却し、オリゴをアニールします。その後、アニールオリゴ混合物を摂氏4度でインキュベートします。今、消化されたPV1524にアニールオリゴをリゲートします。
最初のPCRチューブに、10x T4リガーゼバッファー、t4 DNAリガーゼ、アニールオリゴミックス、消化CIP処理精製プラスミド、水を10マイクロリットルの総体積に加えます。同様に、アニールオリゴミックスの代わりに陰性対照混合物を用いて第2のPCRチューブを調製する。サーモサイクラーに両方のチューブを30分間摂氏16分、摂氏65度で10分間インキュベートし、最後に摂氏25度まで冷却します。
ライゲーションに従い、ライゲーション混合物を化学的に有能な細胞に変換し、テキストプロトコルに記載されているようにプラスミドを精製し、配列します。修復テンプレートを設計するには、遺伝子配列を左クリックし、停止コドンおよび制限消化部位をコードするヌクレオチドを追加してストップコドンを挿入する。左クリックして、突然変異が行われる下流の10塩基をクリックし、カーソルを60塩基上流にドラッグします。
プライマータブで左舐めをしてプライマーを追加します。これにより、修復テンプレートが 3 つ追加されます。次に、突然変異が行われる場所の上流の10塩基を左クリックし、カーソルを下流に60塩基をドラッグします。
プライマータブを左クリックしてプライマーを追加します。これにより、修復テンプレートが 3 つ逆転します。修復テンプレートを生成するには、修復テンプレートフォワードプライマー、修復テンプレートリバースプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、TACHポリメラーゼ、および水を4つのPCRチューブそれぞれに追加します。
20~ 30 ラウンドの PCR を実行してプライマーの拡張を実行します。正しくクローン化されたプラスミドを消化するには、プラスミド、10xバッファー、ウシ血清アルブミン、KPN 1、SAC 1、水を1.5ミリリットルチューブの総体積40マイクロリットルに加えます。一晩摂氏37度でインキュベートします。
一方、C.albicans SC5314、野生型プロトトロフ、ウリジンサプリメントYPDで摂氏25度で一晩培養を成長させます。培養物を600ナノメートルまたはOD600未満で光学密度に成長させます。ペレットは、G2348倍で5分間回転させることによって、1回の変換ごとに5個のOD600個の細胞を、その後、TE/酢酸リチウム100マイクロリットルでペレット化された細胞を一時停止する。
さて、1.5ミリリットルのチューブに、順番に、再懸濁細胞、沸騰し、迅速に冷却されたサケ精子DNA、血漿消化、精製修復テンプレート、およびプレートバッファーを追加します。同じ方法で負のコントロールを準備しますが、変換DNAと同等の体積で水を置き換えます。一晩変換をインキュベートした後、25分間摂氏44度の水浴に入れて細胞を加熱チャックします。
ベンチトップ遠心分離機でGの2348倍で5分間回転し、プレート混合物上清を取り除きます。ウリジン補充YPDと遠心分離機の1ミリリットルを追加して、再び1回洗浄します。ウリジン補充YPDの0.1ミリリットルで細胞を懸濁させた後、ローラードラムまたはシェーカー上の懸濁液を一晩摂氏25度でインキュベートする。
翌日、ウリジン補充YPDの細胞を、ヌルセオトリシンのミリリットル当たり200マイクログラムでプレートします。コロニーは2〜5日で現れ、テキストプロトコルで説明されているように、単一のコロニーに対してストリークする必要があります。コロニーPCRを行うために、導入された制限部位の約200塩基対上流、および下流に約300塩基対の逆プライマーを設計する。
0.3マイクロリットルのフォワードチェックプライマー、0.3マイクロリットルの逆チェックプライマー、0.3マイクロリットルの耐熱性ポリメラーゼ、3マイクロリットルのdNTP、3マイクロリットルのXTACバッファー、23マイクロリットルの水をチューブに加えます。次に、P10ピペットチップを使用して混合物に1つの酵母コロニーの0.25マイクロリットルを加え、アガーを乱さないで注意してください。PCRによってDNAを増幅した後、増幅が成功することを確実にするためにゲル上でPCRの5マイクロリットルを実行し、チューブの底部にある細胞デブリペレットを乱さないように注意してください。
C.AlbicansにおけるCRISPR媒介ゲノム編集の代表的な結果を以下に示す。C.アルビカンスは、C.アルビカンスTPK2をターゲットとするガイドRNAと修復テンプレートで変換されました。EcoR1制限消化部位および修復テンプレートの停止コドンはPAM部位を破壊し、正しい変異体のスクリーニングを容易にする。
コロニー PCR に続いて制限消化により、野生のタイプと編集された配列がすぐに区別されます。この手順を試みる際には、PV1524にクローン化されたガイドRNAの複数のコピーを確認することが重要です。これにより、ゲノム編集効率が低下します。
C.AlbicansはBL2病原体であり、常に適切なラボの服装をし、この手順を実行しながらすべての安全手順に従うことを忘れないでください。
